構(gòu)建hiv病毒抗體酵母展示庫(kù)的方法和篩選病毒廣譜中和性抗體的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種構(gòu)建HIV病毒抗體酵母展示庫(kù)的方法和篩 選病毒廣譜中和性抗體的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 廣譜病毒中和抗體是感染病人獲得性免疫球蛋白，此類抗體廣譜的與病毒顆粒結(jié) 合，阻止其進(jìn)一步感染人體細(xì)胞，可導(dǎo)致病毒顆粒裂解，進(jìn)而引起"中和"反應(yīng)。尤其在易突 變的病毒，譬如HIV治療中及其重要。目前篩選病毒廣譜中和抗體，多利用病人外周血單個(gè) 核淋己細(xì)胞PBMC細(xì)胞，進(jìn)行抗體DNA的擴(kuò)增，利用瞻菌體展示進(jìn)行順次反復(fù)篩選，建立瞻菌 體展示的抗體庫(kù)。
[000引但是，由于中和性抗體的比例小，且極其稀有，若篩選壓力不足，很難從108-10 9庫(kù) 容量的庫(kù)中獲得陽(yáng)性克隆，假陽(yáng)性高。若篩選壓力過(guò)大，容易丟失親和力低但中和性強(qiáng)的抗 體株。因此，瞻菌體篩選的缺點(diǎn)是假陽(yáng)性率高，且篩選過(guò)程不易控制，容易造成有效克隆丟 失。
[0004] 因此有必要提供一種高效、假陽(yáng)性率低、且篩選過(guò)程可控的篩選病毒廣譜中和性 抗體的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明第一方面提供了一種篩選病毒廣譜中和性抗體的方法， 該方法通過(guò)構(gòu)建酵母抗體展示庫(kù)，采用英光標(biāo)記的病毒抗原蛋白，結(jié)合流式細(xì)胞儀分選技 術(shù)篩選病毒廣譜中和性抗體，該流式分選過(guò)程為可視化篩選，通過(guò)設(shè)置細(xì)胞分離口，提高了 篩選過(guò)程的可控性，避免了常規(guī)篩選帶來(lái)的假陽(yáng)性過(guò)高問(wèn)題。本發(fā)明第二方面提供了一種 篩選病毒廣譜中和性抗體的方法的應(yīng)用。本發(fā)明第H方面提供了一種構(gòu)建HIV病毒抗體 酵母展示庫(kù)的方法。本發(fā)明第四方面提供了一種構(gòu)建HIV病毒抗體酵母展示庫(kù)的方法的應(yīng) 用。
[0006] 本發(fā)明所述"單個(gè)核淋己細(xì)胞"是指W淋己細(xì)胞為主的細(xì)胞群體，其中含有少量的 單核細(xì)胞。VH代表抗體重鏈，化代表抗體輕鏈。
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供了一種篩選病毒廣譜中和性抗體的方法，包括如下步驟： [000引（1)提供病毒抗原蛋白；
[0009] (2)采用英光標(biāo)記物對(duì)所述病毒抗原蛋白進(jìn)行標(biāo)記；
[0010] (3)制備病毒陽(yáng)性病人的cDNA模板，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增抗體基因；
[0011] (4)采用所得抗體基因構(gòu)建酵母抗體展示庫(kù)；
[0012] (5)取所得抗體展示庫(kù)中的酵母細(xì)胞與步驟（2)所得具有英光標(biāo)記物的病毒抗原 蛋白混合賠育，然后設(shè)定細(xì)胞分離口，采用流式細(xì)胞儀分選英光陽(yáng)性的酵母細(xì)胞；
[0013] (6)對(duì)所得英光陽(yáng)性的酵母細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序鑒定，得到病毒廣譜中和性抗體。
[0014] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中，所述病毒抗原蛋白為HIV-1型病毒的抗原蛋白。
[0015] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述HIV-1型病毒為HIV-1病毒A、B、B'、C、D、G和F亞型中的至 少一種。
[0016] 進(jìn)一步優(yōu)選地，3、4、所述HIV-1型病毒的抗原蛋白為HIV-1型病毒的甜41抗原蛋 白、甜120抗原蛋白和甜160抗原蛋白中的一種或多種。
[0017] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中，所述采用英光標(biāo)記物對(duì)所述病毒抗原蛋白進(jìn)行標(biāo)記的步 驟為采用不同的英光標(biāo)記物對(duì)不同的所述病毒抗原蛋白分別進(jìn)行標(biāo)記。
[0018] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述不同的英光標(biāo)記物為AlexaFluor# 488、AlexaFluo;r555和 AlexaFluor647中的一種或多種。
[0019] 優(yōu)選地，所述步驟（3)中，所述制備病毒陽(yáng)性病人的cDNA模板的步驟為：制備或 提供HIV-1陽(yáng)性病人外周血單個(gè)核淋己細(xì)胞PBMC，提取總RNA，W隨機(jī)六聚體為引物反轉(zhuǎn)錄 合成cDNA。
[0020] 所述設(shè)計(jì)引物的步驟包括：
[00川a、合成第一輪PCR引物
[002引包括VH上游引物、VH下游引物、VL上游引物、VL下游引物，各引物不含酶切位點(diǎn) 和linker序列；
[002引 b、合成第二輪PCR引物
[0024]將每條第一輪PCR引物的5'端加上linker序列，得到第二輪PCR引物，其中，加 在VH的上游引物和化的下游引物的5'端的linker序列中各有一個(gè)SfiI酶切位點(diǎn)，加 在VH的下游引物和化的上游引物的5'端的linker序列反向互補(bǔ)；
[00巧]所述擴(kuò)增抗體基因的步驟包括：
[0026] SOI、多重PCR擴(kuò)增抗體重鏈：
[0027]W所得cDNA為模板，取第一輪PCR引物的重鏈下游引物等摩爾混合，再分別與重 鏈上游引物進(jìn)行多重PCR，得到第一輪重鏈PCR產(chǎn)物；然后W第二輪PCR引物的重鏈上游引 物等摩爾混合，再分別與重鏈下游引物進(jìn)行第二輪多重PCR，得到第二輪重鏈PCR產(chǎn)物；
[0028]S02、多重PCR擴(kuò)增抗體輕鏈：
[002引 W所得cDNA為模板，取第一輪PCR引物的輕鏈下游引物等摩爾混合，再分別與輕 鏈上游引物進(jìn)行多重PCR，得到第一輪輕鏈PCR產(chǎn)物；然后W第二輪PCR引物的輕鏈上游引 物等摩爾混合，再分別與輕鏈下游引物進(jìn)行第二輪多重PCR，得到第二輪輕鏈PCR產(chǎn)物；
[0030]S03、將步驟SOI所得的第二輪重鏈PCR產(chǎn)物和S02所得的第二輪輕鏈PCR產(chǎn)物混 合進(jìn)行重疊PCR，得到抗體基因。
[0031] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述設(shè)計(jì)引物的步驟中，所述化包括VK和VA鏈。
[0032] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述設(shè)計(jì)引物的步驟中，所述VH上游引物、VH下游引物、VK上游 引物、W及VK下游引物分別有9條、4條、6條W及5條。
[0033] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述9條VH上游引物分別為核巧酸序列如SEQIDNO: 1~9所 示的DNA分子。
[0034] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述4條VH下游引物分別為核巧酸序列如SEQIDNO: 10~13 所示的DM分子。
[003引更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述6條VK上游引物分別為核巧酸序列如SEQIDNO: 14~19 所示的DM分子。
[0036] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述5條Vk下游引物分別為核巧酸序列如SEQIDN0:20~14 所示的DM分子。
[0037] 設(shè)計(jì)第二輪PCR引物時(shí)，加在VH的下游引物和化的上游引物的5'端的linker 序列反向互補(bǔ)，用W通過(guò)重疊PCR獲得VH和化依次相連的抗體基因（ScFv)。
[003引進(jìn)一步優(yōu)選地，所述linker序列的核巧酸序列分別如SEQIDNO:25~28所示， 其中，每條VH上游引物的5'端加上核巧酸序列如SEQIDN0:25所示的Linker,每條VH下 游引物的5'端加上核巧酸序列如SEQIDNO: 26所示的Linker,每條化上游引物的5'端 加上核巧酸序列如SEQIDNO: 27所示的Linker,在每條化下游引物的5'端加上核巧酸序 列如SEQIDNO:28 所示的Linker。
[0039] 在此優(yōu)選情況下，本發(fā)明先采用多重PCR擴(kuò)增抗體的重鏈（VH)和輕鏈（VL)，再通 過(guò)重疊PCR將重鏈和輕鏈進(jìn)行拼接，從而獲得ScFv基因，具體步驟包括；首先W第1鏈cDNA (即RNA逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA)為模板，通過(guò)1stPCR上游引物的混合引物和單條下游引物分別 進(jìn)行多重PCR，獲得1stPCR產(chǎn)物，回收PCR產(chǎn)物。再WistPCR產(chǎn)物為模板，2ndPCR的引 物分別進(jìn)行第二輪多重PCR，分別獲得化dPCR產(chǎn)物，瓊脂糖電泳回收并合并化dPCR產(chǎn)物， 形成化dVHmix和化dVLmix。W化dVHmix和化dVLmix為模板，通過(guò)重疊PCR將其拼 接成ScFv。
[0040] 優(yōu)選地，所述重疊PCR的步驟為：
[00川 先W化dVHmix和化dVLmix為模板，無(wú)引物運(yùn)行PCR2~3個(gè)循環(huán)，再加入VH 上游引物的linkerW及化下游引物的li