催化柚皮苷酯合成反應的細菌細胞催化劑的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)、生物催化及生物醫(yī)藥制備領域，具體涉及催化柚皮苷酯合成反應的細菌細胞催化劑的制備方法。
【背景技術】
[0002]黃酮類化合物是兩個苯環(huán)通過三個碳原子相互連接而形成的一系列重要的多酚類化合物，廣泛存在于幾乎所有的植物，尤其是蔬菜和水果；在醫(yī)藥、食品和化妝品上有很大的應用價值。黃酮有多種生物活性包括抗氧化活性，抗炎，抗癌的，抗菌，抗過敏，和抗病毒等，然而，由于其多羥基結構的特點，大部分黃酮生物活性受限于其低脂溶性或水溶性。位于苯環(huán)或配糖體骨架上的羥基對黃酮的生物和化學活性有重要的影響。黃酮的酯化被認為一種很有前景的方法用于提高黃酮的溶解度，從而使黃酮展示出更多的生理活性。已有研宄表明，有選擇地修飾黃酮類化合物結構不僅可以提高物理化學屬性，例如，熱穩(wěn)定性和光阻系數(shù)；而且增強其生物活性，如抗氧化活性；抗菌活性；細胞滲透能力；減肥和降血脂功能等。柚皮苷又名柚苷、異橙皮苷、柚皮素-7-0-新橙皮糖苷，是一種雙氫黃酮類化合物，主要存在于蕓香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，也是骨碎補、枳實、枳殼、化橘紅等中藥的主要有效成分之一。柚皮苷具有促進骨骼生長、抗氧化、降膽固醇與降血脂、抗腫瘤、提高其他藥物的生物利用度等作用。
[0003]目前黃酮酯類衍生物的合成均采用化學催化劑或者離體酶催化劑。由于黃酮的苯環(huán)或糖環(huán)上羥基眾多，且反應活性相似，采用化學催化劑時存在的主要問題是反應區(qū)域選擇性很低，易產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物及含堿廢液，對環(huán)境造成嚴重污染。酶催化劑較之化學催化劑更為綠色，且區(qū)域選擇性高，反應條件溫和，但是由于酶的分離純化過程復雜且在此過程中酶活性有部分損失，在立體環(huán)境中不穩(wěn)定，易失活等缺點，且酶的價格昂貴，造成酶法反應成本較高，這些方面均嚴重制約了其在工業(yè)化的應用。因此，研宄開發(fā)新型綠色催化劑用于黃酮酯的制備具有重大的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明針對現(xiàn)有用于柚皮苷酯合成的催化劑的不足，提供一種催化柚皮苷酯合成反應的細菌細胞催化劑的制備方法。其制備方法簡單易操作，原材料價廉易購買，不涉及酶的分離純化。用本法制備的可催化柚皮苷酯合成反應的細胞催化劑，可選擇性催化合成柚皮苷6’ ’ -單酯，其區(qū)域選擇性達到97%以上，克服了傳統(tǒng)化學方法的選擇性低導致底物利用率低，產(chǎn)物純度低，易生成副產(chǎn)物等缺點。同為綠色，反應條件溫和的生物催化劑，細胞催化劑較之離體酶催化劑具有穩(wěn)定性高，價廉、易獲取的優(yōu)點。
[0005]本發(fā)明目的通過以下技術方案來實現(xiàn):
一種催化柚皮苷酯合成反應的細菌細胞催化劑的制備方法，包括以下步驟:
I)將細菌種子液接種至含產(chǎn)酶誘導劑的液體培養(yǎng)基中，接種量為0.5%~20% (v/v)，培養(yǎng)條件為30°C ~50°C，培養(yǎng)時間為12~144h ； 2)離心后收集菌體，蒸餾水洗滌兩次，經(jīng)真空冷凍干燥12h-36h，收獲菌體干粉，即為細菌細胞催化劑。
[0006]上述方法中，所述細菌包括施氏假單胞菌stutzeri或銅綠假單胞IMl Pseudomonas aeruginosa 0
[0007]上述方法中，所述液體培養(yǎng)基成分為:0.5~100 g/L產(chǎn)酶誘導劑，0.5~50 g/L有機氮源，0.5 -10 g/L MgSO4.7Η20, 5 g/L (NH4)2SO4,1 g/L K2HPO40
[0008]上述方法中，所述產(chǎn)酶誘導劑包括糖類化合物、飽和植物油脂、不飽和植物油脂、脂肪酸、Tween系列或Span系列中的一種或兩種。
[0009]上述方法中，所述有機氮源包括牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、胰蛋白胨、干酪素、酸水解酪蛋白胨或無氨基酵母膏中的一種或兩種。
[0010]本發(fā)明所用細菌公眾可以從菌種中心購買或自己篩選得到。
[0011]本發(fā)明與現(xiàn)有的技術相比具有如下的優(yōu)點:
1.細菌細胞催化劑為生物催化劑，較之化學催化劑反應條件溫和、環(huán)境友好，區(qū)域選擇性高，選擇性合成柚皮苷的6’ 單酯，其區(qū)域選擇性在90%以上，從而克服了傳統(tǒng)化學方法產(chǎn)物純度低，易生成副產(chǎn)物等缺點。
[0012]2.細菌細胞催化劑營養(yǎng)要求很低，容易培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方簡單，制備易操作，制備成本低。
【具體實施方式】
[0013]為更好理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明做進一步地詳細說明，需要說明的是，這些實施例并不構成對本發(fā)明保護范圍的限制。
[0014]實施例1
將包括銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.￥辨巾子液轉接至含液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為0.5% (v/v)，培養(yǎng)條件為30°C，液體培養(yǎng)基成分為:0.5 g/L大豆油，0.5g/L 酵母膏，0.5 g/L MgSO4*7H20，5 g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 為 7.0。培養(yǎng) 60h 后離心收集濕菌體，蒸餾水洗滌兩次，真空冷凍干燥后得細胞催化劑。該細胞催化劑用于柚皮苷與丙酸乙烯酯的?；磻?，6’ ’ -柚皮苷丙酯區(qū)域選擇性為98.7%。
[0015]本發(fā)明方法得到的催化劑的區(qū)域選擇性以柚皮苷與丙酸乙烯酯區(qū)域選擇性?；磻M行測定，反應條件為在2mL的柚皮苷酯化反應體系中添加SOmg的菌體干粉作為催化劑，以65.8μ I丙酸乙烯酯作為酰基供體，柚皮苷用量為17.4mg，反應體系為90% ( v/v)乙腈-叔戊醇，反應溫度為40°C，振蕩速度ISOrpm，常壓下反應。反應區(qū)域選擇性表征為:6’ -柚皮苷丙酯的產(chǎn)量/黃酮酯的總產(chǎn)量。
[0016]實施例2
將包括銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa GIM1.￥辨巾子液轉接至含液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為0.5% (v/v)，培養(yǎng)條件為50°C，液體培養(yǎng)基成分為:0.5 g/L Tween 80，0.5 g/L 酵母膏，0.5 g/L MgSO4*7H20，5 g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 為 7.0。培養(yǎng)60h后離心收集濕菌體，蒸餾水洗滌兩次，真空冷凍干燥后得細胞催化劑。該細胞催化劑用于柚皮苷與丙酸乙烯酯的?；磻?，6’ ’ -柚皮苷丙酯區(qū)域選擇性為97.7%。
[0017]實施例3 將包括銅綠假單胞菌Pseudomoims aeruginosa GIM1.￥辨巾子液轉接至含液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為20% (v/v)，培養(yǎng)條件為30