多種化學促進劑提高微生物異養(yǎng)發(fā)酵生產二十二碳六烯酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，特別涉及利用多種化學促進劑提高異養(yǎng)微生物發(fā)酵生 產DHA的方法。
【背景技術】
[0002] DHA即二十二碳六稀酸（Docosahexaenoic Acid, DHA)是人腦發(fā)育、成長的重要物 質之一，是大腦和視網膜的重要構成成分，在人體大腦皮層中含量高達20%，在眼睛視網膜 中所占比例最大，約占50%。因此，它對胎兒和嬰幼兒的大腦和視網膜的發(fā)育，以及成年人腦 功能的維修等方面有著重要的作用。此外，DHA對冠心病、中風、高血壓等心血管系統(tǒng)的疾 病、神經失常、老年癡呆癥和抑郁癥等神經系統(tǒng)的疾病也有積極的影響。DHA作為一種必需 脂肪酸，其增強記憶與思維能力、提高智力等作用更為顯著。人群流行病學研宄發(fā)現(xiàn)，體內 DHA含量高的人的心理承受力較強，智力發(fā)育指數(shù)也高。DHA還可用于癌癥治療，抑制發(fā)炎 等。據荷蘭帝斯曼公司的估計，DHA的全球市場價值約為25-26. 2億美元，并且以每年15% 以上的速度增長。
[0003] 截止目前為止，深海魚油一直是市售的DHA的主要來源。但這一主要來源存在諸 多缺點，比如海洋污染造成的對魚油安全性的擔憂，魚油質量會隨著魚的種類、捕撈季節(jié)和 地點的不同而不同，含EPA、易受環(huán)境污染、純化成本高，魚油的特殊氣味也限制了魚油來源 的DHA作為一種食品添加劑的應用。尤其是考慮到DHA的主要消費者是懷孕婦女和年幼的 孩子，其可能的不利影響更令人擔憂；此外，世界漁業(yè)資源的逐年萎縮對DHA的可持續(xù)性供 應的影響也值得考慮。
[0004] 利用隱甲藻（)發(fā)酵生產DHA，與傳統(tǒng)魚油來源相比， 具有一系列優(yōu)點，如發(fā)酵周期短，培養(yǎng)方式簡單，微生物生長快，易于大規(guī)模培養(yǎng)；多不飽和 脂肪酸含量高，產品質量穩(wěn)定，氧化穩(wěn)定性較好，不飽和脂肪酸成分單一，不含EPA或EPA含 量低，易于分離純化；同時克服了傳統(tǒng)的從魚油中獲取DHA受原料、氣候、產地、生產周期等 諸多限制因素的影響。因此微生物發(fā)酵生產DHA可替代魚油來源的DHA，具有廣泛的應用前 景。
[0005] 隱甲藻是一種原始的真核單細胞微生物，營異養(yǎng)生活，在甲藻門中處于較低等的 地位。隱甲藻的細胞周期可粗劃分為細胞生長階段和穩(wěn)定時期，其中穩(wěn)定期是隱甲藻積累 DHA的主要階段。目前工程培養(yǎng)隱甲藻細胞過程中，油脂產量較低。在不抑制隱甲藻自身生 長的前提下，在培養(yǎng)基中添加各類刺激隱甲藻油脂積累的物質成為改善發(fā)酵培養(yǎng)的重要方 向，但是對其代謝機理是不清楚的，這限制了對其的開發(fā)應用。
[0006] 植物生長調節(jié)劑是一類與植物激素具有相似生理和生物學效應的物質，具有調控 植物生長和發(fā)育的功能。作為外源的非營養(yǎng)性化學物質，植物生長調節(jié)劑通?？稍谥参矬w 內傳導至作用部位，以很低的濃度就能促進或抑制其生命過程的某些環(huán)節(jié)，使之向符合人 類的需要發(fā)展。它不僅適用于種植業(yè)中幾乎所有的高等和低等植物，還可用于食用菌及藻 類的生長，且具有用量少、殘毒小的特點。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種利用多種化學促進劑提高異養(yǎng) 微生物發(fā)酵生產DHA的方法。
[0008] 為了解決上述問題，本發(fā)明采用的技術方案是：利用代謝組學分析在一種或兩種 化學促進劑刺激下二十二碳六烯酸累積明顯的寇氏隱甲藻細胞內代謝物豐度的變化情況。
[0009] 本發(fā)明多種化學促進劑提高異養(yǎng)微生物發(fā)酵生產二十二碳六烯酸（DHA)的方法的 特征是，以寇氏隱甲藻的異養(yǎng)培養(yǎng)基為基礎，在其中添加任一種化學促進劑；所說的異養(yǎng)培 養(yǎng)基的組成為：葡萄糖9 g/L，酵母浸粉2 g/L，海鹽25 g/L;所說的化學促進劑也可稱 為植物生長調節(jié)劑，包括吲哚乙酸（IAA)、萘氧乙酸（ΒΝ0Α)、氯苯甲酸、水楊酸（SA)、脫落酸 (ABA)、乙醇胺，這些化學促進劑在所說的異養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為：B引哚乙酸（IAA) 2. 5 mg/ 1，萘氧乙酸0^(^)4 11^凡，氯苯甲酸4 11^凡，水楊酸（34)111^凡，脫落酸（41^)2〇11^凡， 乙醇胺2.5 mM; 25 ° C下培養(yǎng)72小時后，提取油脂，使用氣質聯(lián)用儀測定培養(yǎng)物DHA含量， 使用t檢驗分析添加化學促進劑的樣品與對照之間的顯著性差異，同時從平行培養(yǎng)物中提 取細胞代謝物，利用代謝組學方法檢測分析胞內代謝物的變化情況。
[0010] 在所說的異養(yǎng)培養(yǎng)基中還可添加兩種組合的植物生長調節(jié)劑，即萘氧乙酸（BNOA) 與乙醇胺和水楊酸（SA)與乙醇胺兩種組合；所說的兩種組合的植物生長調節(jié)劑在異養(yǎng)培 養(yǎng)基中的濃度為：萘氧乙酸（BNOA) 4 mg/L，水楊酸（SA) I mg/L，乙醇胺2. 5 mM。
[0011] 通過基于液質聯(lián)用儀（LC-MS)的代謝組分析，糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)以及磷酸 戊糖途徑中代謝物含量與通過在異樣培養(yǎng)基中添加化學促進劑來提高異養(yǎng)微生物胞內DHA 含量有密切聯(lián)系，在不同種化學促進劑的刺激下，異養(yǎng)微生物胞內DHA含量明顯提高的同 時，糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)中的主要代謝物含量均上調，而磷酸戊糖途徑中的代謝物含 量則下調；同時，與DHA累積相關的一系列生物標志物包括葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、 果糖-1，6-二磷酸、磷酸二羥丙酮、乙酰-輔酶A、草酰乙酸、甘油醛-3-磷酸、核糖-5-磷 酸、磷酸烯醇式丙酮酸。
[0012] 本發(fā)明的有益效果是：使用t檢驗分析，表明添加化學促進劑的樣品與對照之間 存在顯著性差異，化學促進劑的添加能有效提高寇氏隱甲藻細胞二十二碳六烯酸（DHA)累 積量，同時，發(fā)現(xiàn)了糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)以及磷酸戊糖途徑與通過在異樣培養(yǎng)基中添加 化學促進劑來提高異養(yǎng)微生物胞內DHA含量有密切聯(lián)系，并且公開了與DHA積累密切相關 的生物標志物。
【附圖說明】
[0013] 圖1為分別添加水楊酸（SA)、乙醇胺以及水楊酸（SA)&乙醇胺混合物培養(yǎng)后，使用 油脂抽提以及氣質聯(lián)用儀（GC-MS/MS)的方法測定的寇氏隱甲藻二十二碳六烯酸（DHA)相 對含量對比圖〈〇.〇5; # /7〈0.01; /7〈0.001)。值小于0.05表明添加化學促 進劑的樣品與對照間存在顯著性差異，值越小，差異越大。
[0014] 圖2為分別添加萘氧乙酸（ΒΝ0Α)、乙醇胺以及萘氧乙酸（BNOA) &乙醇胺混合物培 養(yǎng)后，使用油脂抽提以及氣質聯(lián)用儀（GC-MS/MS)的方法測定的寇氏隱甲藻二十二碳六烯酸 (DHA)相對含量對比圖（* /7〈0.05; # /7〈0.01)。值小于0.05表明添加化學促進劑的 樣品與對照間存在顯著性差異，值越小，差異越大。
[0015] 圖3為添加水楊酸（SAU乙醇胺混合物培養(yǎng)后，使用LC-MS的方法分析寇氏隱甲 藻胞內代謝物的變化情況，圖中加大加粗字體為上調代謝物，加大