降解黃曲霉毒素b1的紅城紅球菌菌株的分離、培養(yǎng)和使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及紅城紅球菌（Rhodococcuserythropolis)菌株的分離、培養(yǎng)和使用方 法。具體而言，本發(fā)明涉及降解黃曲霉毒素B1 (AFB1)的紅城紅球菌菌株的分離方法、由所 述分離方法得到的紅城紅球菌菌株的培養(yǎng)方法以及使用所述紅城紅球菌菌株降解AFB1的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 霉菌毒素是霉菌生長過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。霉菌毒素污染一直是全球食 品、飼料及農(nóng)產(chǎn)品等行業(yè)的重大威脅，每年都給生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失。目前對相關(guān)行 業(yè)威脅最大的霉菌毒素有黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT)、單端孢霉烯族毒素以及玉米赤霉 烯酮等。其中，作為所有真菌毒素中毒性最強的一種，黃曲霉毒素是黃曲霉（A.flavus)、特 曲霉（A.nomius)及寄生曲霉（A.parasiticus)等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已分離出 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFB2a、AFG2a、AFBM2a及AFGM2a等 18 種之多，而其中 AFB1的毒性最強且化學(xué)性質(zhì)最穩(wěn)定，它具有很強的致癌性、致突變性和致畸形性，是國際上 認(rèn)可的A類致癌物。大量的調(diào)查研究證實，肝臟是AFB1主要作用的靶器官，AFB1能夠?qū)е?肝臟壞死、肝癌的形成；此外AFB1還會影響動物胚胎發(fā)育，造成免疫抑制和反復(fù)感染，降低 某些動物的產(chǎn)奶和產(chǎn)蛋量。
[0003]黃曲霉毒素廣泛存在于各種飼料原料和各種食品原料中，主要包括玉米、花生等 食品、飼料及原材料，既嚴(yán)重影響我國相關(guān)產(chǎn)品的進出口貿(mào)易，帶來了巨大的經(jīng)濟損失；又 嚴(yán)重影響了我國的食品及飼料安全與質(zhì)量，造成了極大的人畜健康的危害。
[0004] 因此，發(fā)明一種高效安全的黃曲霉毒素脫毒方法就顯得尤為迫切。自從1960年黃 曲霉毒素被發(fā)現(xiàn)以來，科研工作者便不斷地研究該類毒素的預(yù)防和去毒方法。目前對黃曲 霉毒素脫毒方法的研究主要都集中在化學(xué)處理法和物理脫毒法等，包括氨化法、堿法、介質(zhì) 吸附法、混合溶劑萃取法、高溫法、紫外線照射法、超濾-滲濾法、霉粒挑選法等，這些方法 存在效果不穩(wěn)定、營養(yǎng)成分損失較大、感官品質(zhì)影響較大、需要添加防毒害的安全設(shè)備、難 以規(guī)?；a(chǎn)等缺點，有些方法需要的設(shè)備價格昂貴，從而限制了實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0005]對此，利用微生物去除黃曲霉毒素的方法由于效率高、條件溫和、無副作用等越來 越受到關(guān)注。利用微生物脫毒的報道，多集中于近十五年。國外的研究報道較多地集中在 乳酸菌、雙歧桿菌、酵母菌及白腐真菌等，橙色黃桿菌、假密環(huán)菌及根霉菌等也有報道。國 內(nèi)相關(guān)研究不多，主要包括劉大嶺等報道(真菌提取液對黃曲霉毒素降解作用的研究[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報，1995,11 (2) :92~94)發(fā)現(xiàn)一種真菌代謝產(chǎn)物具有降解毒素作用；計成 等報道（降解黃曲霉毒素枯草芽孢桿菌的解毒性、抗菌性及抗逆性研究，飼料工業(yè)，2011， 32(24) :23~27)發(fā)現(xiàn)一株芽孢桿菌具有降解毒素作用；及劉陽等報道(高產(chǎn)漆酶平菇的篩 選及其在降解黃曲霉毒素B1中的應(yīng)用，核農(nóng)學(xué)報，2012, 26(7) : 1025-1030)發(fā)現(xiàn)一株平菇 具有降解毒素作用等。
[0006] 對乳酸菌、雙歧桿菌和酵母菌的研究表明，大部分菌去除毒素的效率低于50%。而 對其它一些細(xì)菌及真菌的脫毒研究同樣也發(fā)現(xiàn)，大部分菌的毒素降解效率不高，降解效率 影響因素較多，包括作用時間、溶液pH值、溶液成分、菌體數(shù)量、毒素濃度和金屬離子等，同 時降解操作工藝復(fù)雜，難以大規(guī)模實施。
[0007] 因此，發(fā)明和推廣一種使用微生物來高效地、適用面廣地降解黃曲霉毒素，進而利 用該微生物進行飼料、食品、釀造調(diào)味品和相應(yīng)原料中黃曲霉毒素脫毒的應(yīng)用，對保障飼 料、食品及釀造調(diào)味品質(zhì)量安全并確保人畜健康顯得尤為重要，同時，這還能夠促進我國相 關(guān)產(chǎn)品的進出口貿(mào)易，具有帶來巨大經(jīng)濟利益的潛能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 至今為止，國內(nèi)外尚無關(guān)于利用紅城紅球菌降解黃曲霉毒素的報道。本發(fā)明人則 通過深入研究，首次發(fā)現(xiàn)紅城紅球菌能夠高效率地降解AFB1，從而提供了一種降解AFB1的 紅城紅球菌菌株的分離方法及由此得到的紅城紅球菌菌株；還提供了一種高效的、適用面 廣的、溫和的、安全的、工藝簡單的AFB1降解方法。
[0009] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種降解AFB1的紅城紅球菌菌株的 分離方法。所述分離方法包括如下步驟：利用以AFB1為唯一碳源的初篩培養(yǎng)基進行初篩； 通過16SrDNA序列分析初步選擇出紅城紅球菌菌株；以及利用添加有AFB1的復(fù)篩培養(yǎng)基 進行復(fù)篩，得到所述降解AFB1的紅城紅球菌菌株，其中，所述初篩培養(yǎng)基及復(fù)篩培養(yǎng)基中 含有 0. 10%-1. 00% 的AFB1。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了利用上述分離方法得到的降解AFB1的 紅城紅球菌菌株。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種由上述分離方法得到的降解AFB1 的紅城紅球菌菌株的發(fā)酵培養(yǎng)方法，所述方法包括如下步驟：將所述紅城紅球菌菌株接種 入發(fā)酵培養(yǎng)基中并進行搖瓶發(fā)酵。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種利用由上述分離方法得到的紅城紅 球菌菌株降解AFB1的方法。所述降解AFB1的方法包括如下步驟：取所述紅城紅球菌菌株 的發(fā)酵液或發(fā)酵液上清加入到含AFB1的樣品中，調(diào)整反應(yīng)體系至pH5. 5-8. 5,在25-35°C及 80-150r/min的條件下反應(yīng)48-72h。
[0013] 本發(fā)明涉及的紅城紅球菌菌株分離方法、由此得到的紅城紅球菌菌株及利用該菌 株進行的降解AFB1的方法具有以下有益效果，從而有效解決了傳統(tǒng)黃曲霉毒素AFB1脫毒 方法中存在的問題：
[0014] (1)本發(fā)明的降解AFB1的紅城紅球菌菌株的分離方法具有原料來源廣泛、適用面 廣、工藝簡單、成本低廉等特點；
[0015] (2)利用由本發(fā)明的分離方法得到的紅城紅球菌菌株降解AFB1的效率高，對AFB1 的降解率超過80%，甚至可達到95% ;
[0016] (3)利用由本發(fā)明的分離方法得到的紅城紅球菌菌株降解AFB1的方法具有脫毒 活性高、操作簡單、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)勢。
【具體實施方式】
[0017] 本文所述的降解AFB1的紅城紅球菌菌株可從多種原料來源中分離得到。本領(lǐng)域 技術(shù)人員熟知的是，多環(huán)芳烴（PAH)污染土壤、霉變糧食及腐敗食品等樣品中紅城紅球菌含 量較高，因此，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，降解AFB1的紅城紅球菌菌株的分離方法中可 利用上述樣品作為原料，但本發(fā)明并不限于此。
[0018] 本發(fā)明的降解AFB1的紅城紅球菌菌株的分離方法中使用的初篩培養(yǎng)基可為本領(lǐng) 域技術(shù)人員熟知的任何合適的化學(xué)限定培養(yǎng)基，只要該培養(yǎng)基以AFB1為唯一碳源且含有 0? 10%-L00% 的AFB1 即可。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，所述初篩培養(yǎng)基包含如下成分：磷酸氫二銨 0? 01%-0. 50%、磷酸二氫鈉 0? 01%-0. 50%、磷酸氫二鉀 0? 01%-0. 50%、硫酸鎂 0? 01%-0. 50%、 硝酸鈉〇. 〇1%_〇. 50%、AFB10. 10%-1. 00%、瓊脂0. 50%-2. 00% ;所述初篩培養(yǎng)基的pH為 5. 5-8. 5。優(yōu)選地，所述初篩培養(yǎng)基包含如下成分：磷酸氫二銨0. 05%、磷酸二氫鈉0. 25%、磷 酸氫二鉀0. 20%、硫酸鎂0. 05%、硝酸鈉0. 30%、AFB10. 30%、瓊脂1. 25-2. 00% ;所述初篩培養(yǎng) 基的pH為 6. 0-8.0。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，在進行初篩后，依據(jù)NCBI提供的序列信息，通過16S rDNA序列分析初步選擇出紅城紅球菌菌株用于復(fù)篩。
[0021] 本發(fā)明的降解AFB1的紅城紅球菌菌株的分離方法中使用的復(fù)篩培養(yǎng)基可為本領(lǐng) 域技術(shù)人員熟知的任何合適的培養(yǎng)基，只要該培養(yǎng)基含有〇. 10%-1. 〇〇%的AFB1即可。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，在復(fù)篩過程中，可利用含有濃度為0. 10%-1. 00%的 AFB1的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式，所述復(fù)篩培養(yǎng)基包含如下 成分：蛋白胨 〇? 25%-L00%、牛肉膏 0? 25%-L00%、氯化鈉 0? 25%-L00%、AFB10. 10%-L00%、 瓊脂0? 50%-2. 00% ;所述復(fù)篩培養(yǎng)基的pH為5. 5-8. 5。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式，由本發(fā)明的降解AFB1的紅城紅球菌菌株的 分離方法得到的紅城紅球菌（Rhodococcuserythropolis)菌株分別為NHRI-1、NHRI-2、 順尺1-3、順1?1-4、順1?1-5、順1?1-6及順1?1-7，所述菌株于2013年12月17日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國 科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號分別為CGMCCNo. 8590、CG