一種類芽孢桿菌細菌素制劑的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種類芽孢桿菌細菌素制劑的制備方法及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細菌素是某些細菌產(chǎn)生的具有抗菌活性的物質(zhì),主要成分為多肽、蛋白質(zhì)或蛋白 質(zhì)復(fù)合物,最早由Jacob于1953年提出。近年來,廣譜抗生素的普及甚至濫用所帶來的負面 效應(yīng)日益突出,新型抗生素替代品的研宄迫在眉睫。作為蛋白質(zhì)類物質(zhì)的細菌素,由于可被 蛋白酶降解,其安全性很高,故受到越來越多的關(guān)注。盡管目前開發(fā)獲得的細菌素(Nisin) 已具備了極高的防腐與抑菌的應(yīng)用價值,但受Nisin本身的特性(低pH條件下性質(zhì)穩(wěn)定, pH>7. 0抑菌活性逐漸喪失)的影響,其應(yīng)用的范圍受到了極大的局限性,其次,制備細菌素 的成本非常高、細菌素的來源相對有限,上述問題很大程度上限制了細菌素的開發(fā)和利用。
[0003] 中國專利申請(CN 103740618A)公開了類芽孢桿菌屬的一個新菌種, Paenibacillus damxungensis sp.nov.,并將其中的模式菌株 BD3526 于 2013 年 10 月 14 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),該菌株的保藏編號為: CGMCC No. 8333,該菌株的菌落非常粘稠,表明該菌株具有高產(chǎn)胞外多糖的生理特性,但尚 未得到該菌株產(chǎn)出的抑菌性細菌素。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 因此,本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有細菌素制劑穩(wěn)定性差,制備成本高, 來源不足的現(xiàn)狀,提供了一種類芽孢桿菌細菌素制劑的制備方法及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)CGMCC No. 8333菌株的發(fā)酵液上 清,經(jīng)乙醇沉淀處理后可獲得具有強烈抑菌活性的細菌素制劑,從而完成了本發(fā)明。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一為:一種類芽孢桿菌細菌素制 劑的制備方法,所述制備方法包括以下步驟:
[0007] (1)將類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)接種于培養(yǎng)類芽孢桿菌的培養(yǎng)基中,震 蕩發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液,將所得發(fā)酵液離心取上清液;
[0008] (2)將步驟⑴上清液與乙醇混合,乙醇與上清液混合的體積比為2:1~4:1,將 所得混合液靜置,靜置的溫度為2~10°C,靜置的時間為12~36小時,將混合液離心收集 沉淀物,除去溶劑即得。
[0009] 其中步驟(1)為將類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)接種于培養(yǎng)類芽孢桿菌的 培養(yǎng)基中,震蕩發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液,將所得發(fā)酵液離心取上清液。其中所述類芽孢桿菌 (Paenibacillus sp.)為本領(lǐng)域常規(guī)的類芽孢桿菌,較佳地為發(fā)酵產(chǎn)生細菌素的類芽孢桿 菌,更佳地為類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.),其保藏編號為CGMCC No. 8333。所述類芽 孢桿菌為現(xiàn)有技術(shù),其制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法,或者通過從保藏中心購買獲得。其 中所述養(yǎng)類芽孢桿菌的培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)基,所述培養(yǎng)基的配方較佳地為:氮源 1 ~3%、碳源 1 ~10%、L-胱氨酸 0? 01 ~0? 03%、硫酸鈉 0? 01 ~0? 03%、Na2HP04.12H20 0? 1~0.3%、乙酸鈉1~3%、氯化鈉0.05~0? 15%、碳酸氫鈉0? 1~0.3%,余量為水,所 述百分比為質(zhì)量百分比。其中所述氮源為本領(lǐng)域常規(guī)氮源,只要能夠為類芽孢桿菌的發(fā)酵 提供氮元素即可,所述氮源較佳地為酵母膏,蛋白胨和/或酪朊水解物中的一種或多種。其 中所述碳源為本領(lǐng)域常規(guī)的碳源,只要能夠為類芽孢桿菌的發(fā)酵提供碳元素即可,所述碳 源較佳地為蔗糖和/或糖蜜。其中所述類芽孢桿菌的接種量較佳地為1~5%,更佳地為 1. 5~4%,最優(yōu)地為2%,所述百分比為體積百分比,所述類芽孢桿菌的發(fā)酵溫度較佳地為 25~37°C,更佳地為32~35°C,所述發(fā)酵的時間較佳地為18~48小時,更佳地為24~ 36小時,優(yōu)選地為30小時,所述震蕩培養(yǎng)的速度較佳地為100~300rpm,更佳地為150~ 200rpm,優(yōu)選地為 180rpm。
[0010] 本發(fā)明所述的發(fā)酵方法將所述類芽孢桿菌CGMCCNo. 8333接種于培養(yǎng)基之前,較 佳地還包括該類芽孢桿菌CGMCCNo. 8333活化獲得類芽孢桿菌種子的步驟。所述步驟較 佳地包括以下步驟:將本發(fā)明所述類芽孢桿菌CGMCCNo. 8333接種在TYC固體培養(yǎng)基中, 25~30°C培養(yǎng)18~28小時即得類芽孢桿菌CGMCCNo. 8333種子;將所得類芽孢桿菌CGMCC No. 8333種子的菌落均勻分散于TYC液體培養(yǎng)基內(nèi),再按2%~5%體積百分比的接種量接 種于TYC液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng),搖床轉(zhuǎn)速為100~200rpm,培養(yǎng)18-28小時,將所得培養(yǎng) 物離心棄去上清,所得菌體用無菌蒸餾水洗滌后,用原培養(yǎng)體積的無菌蒸餾水懸浮,即得發(fā) 酵用的類芽孢桿菌的種子。
[0011] 其中步驟(2)為將步驟(1)上清液與乙醇混合,乙醇與上清液混合的體積比為 2:1~4:1,將所得混合液靜置,靜置的溫度為2~10°C,靜置的時間為12~36小時,將混 合液離心收集沉淀物,除去溶劑,即得。
[0012] 其中所述離心的速度較佳地為8, 000~15, 000g,更佳地為10, 000~12, 000g,離 心的時間較佳地為5~15分鐘,更佳地為8~10分鐘,離心的溫度較佳地為4~8°C,更佳 地為5~7°C。其中所述乙醇與上清液混合的體積比為較佳地為2:1~4:1,更佳地為3:1, 所述靜置的溫度較佳地為2~10°C,更佳地為5~8°C,所述靜置的時間較佳地為12~36 小時,更佳地為18~30小時,最佳地為24小時。其中所述乙醇為本領(lǐng)域常規(guī)的乙醇,更佳 地為無水乙醇。當所述離心的條件或者乙醇沉淀條件的技術(shù)參數(shù)值在本發(fā)明請求保護范圍 之外時,會使所得類芽孢桿菌細菌素制劑的抑菌活性顯著降低。
[0013] 為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明采取的技術(shù)方案之二為:一種如本發(fā)明所述制備方 法所得類芽孢桿菌細菌素制劑。
[0014] 本發(fā)明所述類芽孢桿菌細菌素制劑的制備方法中各步驟技術(shù)特征的優(yōu)選范圍與 上文所述制備方法中相應(yīng)的技術(shù)內(nèi)容完全一致,具體請參見上文所述技術(shù)內(nèi)容,此處不再 贅述。
[0015] 為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明采取的技術(shù)方案之三為:如本發(fā)明所述的類芽孢桿 菌細菌素制劑在制備食品防腐劑中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明所述類芽孢桿菌細菌素制劑可以廣泛應(yīng)用于制備各種食品防腐劑,功能性 食品或者功能性飼料中。所述應(yīng)用較佳地為在制備食品防腐劑中的應(yīng)用。
[0017] 在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上,上述各優(yōu)選條件,可任意組合,即得本發(fā)明各較佳實 例。
[0018] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0019] 本發(fā)明的積極進步效果在于:
[0020] 1、解決了當前細菌素來源狹隘的現(xiàn)狀,開創(chuàng)性地將類芽孢桿菌應(yīng)用于細菌素制劑 的制備方法;
[0021] 2、與傳統(tǒng)細菌素Nisin相比,采用本發(fā)明制備的細菌素制劑性質(zhì)更穩(wěn)定,尤其在 中性條件下抑菌活性顯著高于Nisin,因此,具有比Nisin更優(yōu)的應(yīng)用價值;
[0022] 3、采用本發(fā)明制備的類芽孢桿菌細菌素制劑可以直接用于食品的生產(chǎn),從而達到 抑制腐敗菌的增殖,延長食品貨架期的目的,進而降低了食品防腐劑的應(yīng)用成本。
【具體實施方式】
[0023] 下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明,但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,按照常規(guī)方法和條件,或按照商 品說明書選擇。本發(fā)明中所述的"室溫"是指進行試驗的操作間的溫度,