可多次交換的無標(biāo)記定點(diǎn)整合轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及可多次交換的無標(biāo)記定點(diǎn)整合轉(zhuǎn) 基因系統(tǒng)及其應(yīng)用，更具體地，涉及轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 非人轉(zhuǎn)基因動物能夠作為篩選和鑒定藥物的理想模型，從而可W用于研究基因功 能，為人類探討疾病發(fā)病機(jī)理，尋求有效治療途徑，也可W用于動物遺傳品質(zhì)改良的研究。 轉(zhuǎn)基因動物研究蘊(yùn)含著巨大的經(jīng)濟(jì)價值，具有非常廣闊的應(yīng)用前景，目前在國際上成為生 物工程的投資熱點(diǎn)之一，也推動了轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的發(fā)展。
[0003] 當(dāng)前，動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用十分廣泛，多個物種的轉(zhuǎn)基因個體制備已較為成熟，用 于基礎(chǔ)研究、生物醫(yī)學(xué)W及農(nóng)業(yè)應(yīng)用等方面的各種轉(zhuǎn)基因品系也日益豐富，特別是品系繁 多的轉(zhuǎn)基因小鼠，為生物醫(yī)藥和基因生理功能研究提供了堅實基礎(chǔ)。盡管如此，動物轉(zhuǎn)基因 技術(shù)的應(yīng)用尚存在效率、安全W及穩(wěn)定性的問題，特別是家畜動物轉(zhuǎn)基因，效率低下、制備 周期長、遺傳不穩(wěn)定、品系培育周期長、代價高。
[0004] 因而，現(xiàn)階段的動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)仍有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的 在于提出一種簡單、快捷、高效的無標(biāo)記定點(diǎn)整合轉(zhuǎn)基因技術(shù)。
[0006] 需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0007] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，目前的動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，效率低下、制備周期長、遺傳不穩(wěn)定、品系培 育周期長、代價高，具體原因主要有：一方面，表達(dá)、遺傳不穩(wěn)定，難W獲得表型明顯的轉(zhuǎn)基 因動物；另一方面，受抗性基因或其他標(biāo)記因素的影響，即使制備出表型明顯的轉(zhuǎn)基因動 物，仍然難W推廣。因而，發(fā)明人認(rèn)為，如果W無標(biāo)記、定點(diǎn)整合技術(shù)為基礎(chǔ)制備轉(zhuǎn)基因動 物，不僅可W提高轉(zhuǎn)基因效率和遺傳的穩(wěn)定性，為今后品系的培育奠定堅實的基礎(chǔ)，同時， 也有助于消除公眾恐慌，加快轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。因此，不論從社會需求還 是經(jīng)濟(jì)需求方面考慮，無標(biāo)記定點(diǎn)整合轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究都有著重大的價值。
[0008] 另外，整合酶介導(dǎo)的定點(diǎn)整合外源基因系統(tǒng)的發(fā)展過程中，科學(xué)家陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了哺 乳動物基因組的"友好"位點(diǎn)，即可使外源基因在基因組中高效表達(dá)并穩(wěn)定遺傳的位點(diǎn)?；?因組的友好位點(diǎn)主要有四類：逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒整合位點(diǎn)，腺病毒整合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)座子位 點(diǎn)，OC31整合酶識別的假attp位點(diǎn)。其中，R0SA26位點(diǎn)起源于逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)小鼠ES細(xì) 胞的基因捕獲掃描，插入該位點(diǎn)的基因可廣泛表達(dá)于胚胎發(fā)育的各個時期W及各種組織， 是在小鼠發(fā)現(xiàn)的第一個高效表達(dá)外源基因的友好位點(diǎn)。自發(fā)現(xiàn)W來，該位點(diǎn)整合表達(dá)過多 種基因，現(xiàn)在已成為小鼠ES細(xì)胞系中標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)。在人的ES細(xì)胞系，Irion等根據(jù) 小鼠R0SA26同源性也發(fā)現(xiàn)了人的R0SA26位點(diǎn)，并用無啟動子RFP驗證了該位點(diǎn)的有效性。 家畜動物有些物種基因組分析結(jié)果也已經(jīng)確定R0SA26位點(diǎn)，但至今仍無任何該位點(diǎn)整合 基因的報道。
[0009] 而本發(fā)明整合TALEN、RMCE等多項技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因在動物尤其是家畜動 物基因組上的定點(diǎn)插入，且不含任何抗性標(biāo)記基因，可W穩(wěn)定遺傳到下一代，是安全、高效、 穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因動物制備技術(shù)。具體地：
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該 系統(tǒng)包括；第一構(gòu)建體，所述第一構(gòu)建體為TALEN載體，所述TALEN載體識別并剪切友好位 點(diǎn)序列；第二構(gòu)建體，所述第二構(gòu)建體包含左同源臂、右同源臂、篩選標(biāo)記表達(dá)框和第一整 合酶識別序列l(wèi)oxp和10x2272,所述篩選標(biāo)記表達(dá)框位于所述左同源臂和所述右同源臂之 間，所述loxp位于所述左同源臂下游，所述10x2272位于所述右同源臂上游；第H構(gòu)建體， 所述第H構(gòu)建體包含目的外源基因和第二整合酶識別序列l(wèi)oxp'和10x2272'，所述目的外 源基因位于所述loxp'和所述10x2272'之間；W及第四構(gòu)建體，所述第四構(gòu)建體包含整合 酶基因表達(dá)框。
[0011] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)能夠簡單、快捷、高效地實現(xiàn)目的外 源基因在動物尤其是家畜動物基因組上的定點(diǎn)插入，且制備獲得的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞甚至轉(zhuǎn) 基因動物個體不含任何抗性標(biāo)記基因，制備周期短、安全可靠，目的外源基因能夠穩(wěn)定遺傳 到下一代。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種制備轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的方法。根據(jù) 本發(fā)明的實施例，該方法利用前面所述的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。由此，利用該方法能夠 簡單、快捷、高效地實現(xiàn)目的外源基因在動物尤其是家畜動物基因組上的定點(diǎn)插入，有效地 制備獲得不含任何抗性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞甚至轉(zhuǎn)基因動物個體，且該方法操作簡 單、制備周期短、可重復(fù)性好，安全高效，目的外源基因能夠穩(wěn)定遺傳到下一代，進(jìn)而用于品 系培育或動物模型培養(yǎng)時，所需周期短、代價小。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實 施例，該轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞是通過前面所述的制備轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的方法制備獲得的。根據(jù) 本發(fā)明的實施例，該轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞不含任何抗性標(biāo)記基因，安全高效，并且其所包含的外 源基因能夠穩(wěn)定遺傳，因而能夠有效用于進(jìn)行品系培育或動物模型培養(yǎng)。
[0014] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
【附圖說明】
[0015] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中：
[0016] 圖1是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的制備轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的方法的流程示意圖；
[0017] 圖2是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的第一構(gòu)建體TALEN1載體和TALAN2載體的結(jié)構(gòu)示 意圖，其中RVDs是TALEN的模塊排列順序；
[0018] 圖3是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的第一構(gòu)建體TALEN1載體和TALEN2載體的電泳檢 測結(jié)果圖，其中，
[0019] 圖3a是TALEN載體箇液PCR結(jié)果，
[0020] 圖3b是第一構(gòu)建體的質(zhì)粒和酶切鑒定電泳圖；
[0021] 圖4是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的第一構(gòu)建體的活性鑒定結(jié)果；
[0022] 圖5是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的第二構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0023]圖6是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的PR26打祀載體的各元件PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果， W及終載體質(zhì)粒和酶切鑒定結(jié)果，其中，
[0024]圖6a是打祀載體構(gòu)建所需元件的PCR擴(kuò)增結(jié)果，
[00巧]圖化是打祀載體質(zhì)粒和化el酶切鑒定結(jié)果；
[0026] 圖7是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的pR26打祀細(xì)胞克隆鑒定結(jié)果；
[0027] 圖8是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的pR26打祀細(xì)胞克隆鑒定結(jié)果；
[0028]圖9是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的第H構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0029] 圖10是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的第H構(gòu)建體構(gòu)建過程中的電泳檢測結(jié)果圖，其 中，
[0030]圖 10a是骨架載體loxp-mcs-lox2272-T菌液PCR結(jié)果，
[0031] 圖10b是骨架載體酶切及目的片段酶切結(jié)果，
[0032] 圖10c是第H構(gòu)建體酶切鑒定結(jié)果；
[0033]圖11是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的第四構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0034] 圖12是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的第四構(gòu)建體構(gòu)建過程中的電泳檢測結(jié)果圖；W 及
[003引圖13是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的EGFP定點(diǎn)整合的PCR驗證結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0036] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出。下面通過參考 附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0037] 需要說明的是，術(shù)語"第一"、"第二"僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相 對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有"第一"、"第二"的特征可 W明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的描述中，除非另有說 明，"多個"的含義是兩個或兩個W上。
[0038] 首先，需要說明的是，在本發(fā)明中所使用的術(shù)語"構(gòu)建體"是指該樣的一種遺傳載 體，其包含特定核酸序列，并且能夠?qū)⒛康暮怂嵝蛄校茨康耐庠椿颍┺D(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，使 目的核酸序列整合到宿主細(xì)胞的基因組上，W獲得重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，構(gòu)建 體的形式不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實施例，其可W為質(zhì)粒、瞻菌體、人工染色體、粘粒 (Cosmid)、病毒的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，構(gòu)建體呈質(zhì)粒的形式。質(zhì)粒作為遺傳 載體，具有操作簡單，可W攜帶較大片段的性質(zhì)，便于操作和處理。質(zhì)粒的形式也不受特別 限制，既可W是環(huán)形質(zhì)粒，也可W是線性質(zhì)粒，即可W是單鏈的，也可W是雙鏈的。本領(lǐng)域技 術(shù)人員可W根據(jù)需要進(jìn)行選擇。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語"核酸"可W是任何包含脫氧核 糖核巧酸或者核糖核巧酸的聚合物，包括但不限于經(jīng)過修飾的或者未經(jīng)修飾的DNA、RNA，其 長度不受任何特別限制。對于用于構(gòu)建重組細(xì)胞的構(gòu)建體，優(yōu)選所述核酸為D