帶魚魚骨鐵螯合膠原肽制備方法
【專利說明】帶魚魚骨鐵螯合膠原肽制備方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于水產(chǎn)品精深加工技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種帶魚魚骨鐵螯合膠原肽制備方法。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]膠原肽是采用酶切技術(shù)從膠原蛋白中制備的平均分子量在I 000 Da左右的水解產(chǎn)物，相對膠原蛋白復(fù)雜的三級超螺旋結(jié)構(gòu)，膠原肽的線狀結(jié)構(gòu)使其無需分解即可被人體吸收利用，消化吸收率高達(dá)80%。相對于膠原蛋白等大分子物質(zhì)，膠原肽可以有效滲入真皮層，延長皮膚細(xì)胞壽命、抵抗自由基對DNA的攻擊、抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、促進(jìn)膠原蛋白和透明質(zhì)酸的合成、提高皮膚免疫力和保水能力等多種作用，使其成為藥品、保健品和日化產(chǎn)品領(lǐng)域所競相關(guān)注的焦點(diǎn)。
[0005]鐵是人體需要量最多的微量元素，其生理作用主要有:構(gòu)成血紅素，預(yù)防貧血；參與細(xì)胞色素合成，調(diào)解組織呼吸和能量代謝；維持機(jī)體的免疫力和抗感染能力。而缺鐵會導(dǎo)致食欲不振，煩躁不安，活動后呼吸急促、脈搏加快，還可有肝、脾腫大，貧血或者血象障礙；兒童缺鐵可出現(xiàn)偏食、異食癖、智力下降、易怒不安、易發(fā)生感染等癥狀。據(jù)聯(lián)合國兒童基金會統(tǒng)計，全球約有37億人缺鐵，發(fā)展中國家40%?50%的5周歲以下兒童和超過50%的孕婦患缺鐵病。因此，合理補(bǔ)鐵和提高鐵的體內(nèi)吸收率至關(guān)重要?，F(xiàn)有研宄證明而鐵與金屬螯合肽形成的螯合鹽，即可促進(jìn)鐵的吸收，同時又能滿足機(jī)體對活性肽、氨基酸等的需求，是比較理想的補(bǔ)鐵物質(zhì)。
[0006]帶魚在我國的渤海、黃海、東海一直到南海都有分布，和大黃魚、小黃魚及烏賊并稱為中國的四大海產(chǎn)。但是帶魚加工過程中產(chǎn)生的魚骨多數(shù)加工成魚骨粉或者作為廢棄物丟掉，浪費(fèi)的寶貴的漁業(yè)資源。經(jīng)檢索，以帶魚魚骨膠原蛋白制備鐵螯合膠原肽未見報道?；诖耍景l(fā)明根據(jù)鐵螯合膠原肽和帶魚魚骨的利用現(xiàn)狀，提供一種具有金屬鐵螯合活性的膠原肽，并提供這種鐵螯合膠原肽的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有高Fe螯合活性帶魚魚骨鐵螯合膠原肽的制備方法。
[0008]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種帶魚魚骨鐵螯合膠原肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
I)帶魚魚骨的預(yù)處理:將帶魚魚骨按照料液比I g: 15?20 mL加入到NaOH溶液(0.1mol/L)于I?4°C下浸泡2?4 h，脫除非膠原蛋白；處理后帶魚魚骨用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性、瀝干，按照料液比I g: 5?8 mL加入pH 7.4的EDTA溶液(0.5 mol/L),于I?4°C下浸泡2?3天(每天更換I次EDTA溶液)，蒸餾水洗滌2?3次，干燥、粉碎，得脫鈣帶魚魚骨粉。
[0009]2)帶魚魚骨膠原蛋白的制備:將脫鈣帶魚魚骨粉按照料液比I g:5?8 mL加入到0.5 mol/L乙酸溶液并在I?4°C下動態(tài)浸泡3 d，10 000貧離心20?25 min，取上清液，并加入NaCl至溶液終濃度為1.0 mol/L，靜置60?90 min, 12 OOO1^離心25?30 min得沉淀物，冷凍干燥即為帶魚魚骨膠原蛋白。
[0010])帶魚魚骨膠原蛋白的酶解:將帶魚魚骨膠原蛋白按照料液比Ig: 20?25 mL加入到磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.0,0.2 mol/L)，按照膠原蛋白質(zhì)量的1.5?2.0%向溶液中加入復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(I 000 LAPU/g)，于溫度45?50°C酶解4?6 h后，將溶液升溫至90?95°C，并于此溫度保持10?15min后，冷卻至45?50°C ;按照膠原蛋白質(zhì)量的1.2?1.5%向溶液中加入中性蛋白酶(1.0X 15 U/g)，于溫度45?50°C下酶解4?6 h，將溶液升溫至90?95°C，并于此溫度保持10?15min后，8 OOOg離心25?30min，取上清液，即為酶解產(chǎn)物；
5)帶魚魚骨鐵螯合膠原肽的制備:將制備的酶解產(chǎn)物采用I kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液依次經(jīng)固定化鐵離子親和層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到帶魚魚骨鐵螯合膠原肽。
[0011]作為優(yōu)選，所述步驟I)的帶魚為帶魚(TricAiwiw1S haumela)0
[0012]作為優(yōu)選，所述步驟5)的固定化鐵離子親和層析和RP-HPLC純化的具體過程為: 固定化鐵離子親和層析:將上述超濾酶解液溶于雙蒸水配成濃度為10?20 mg/mL的溶液，經(jīng)過固定化鐵離子Sepharose 6B親和層析柱吸附后，用5?8倍柱體積雙蒸水洗脫除去未吸附多肽，然后用3?5倍柱體積的pH 3.0的雙蒸水洗脫層析柱，收集洗脫液，凍干，得親和層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述親和層析酶解物用雙蒸水配成80?100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化，根據(jù)對鐵離子的螯合活性得I個高Fe螯合活性膠原肽Gly-P1-P1-Gly-Pro-Trp-Gly-Pro-His-Gly (GPPGPffGPHG)0
[0013]再優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為:進(jìn)樣量15?20 μ L ;色譜柱Zorbax C18 (250 X
4.6mm, 5 μπι);流動相25%乙腈；洗脫速度1.0?1.5 mL/min ;紫外檢測波長214 nm。
[0014]本發(fā)明根據(jù)多肽與金屬離子螯合的理論基礎(chǔ)，以及多肽-Fe螯合物在補(bǔ)鐵上的顯著優(yōu)點(diǎn)，以帶魚魚骨為原材料，通過對復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解條件控制，制備具有高Fe螯合活性的膠原肽。本發(fā)明可為補(bǔ)鐵藥物和功能產(chǎn)品開發(fā)，以及帶魚魚骨的高值化利用提供技術(shù)支持。
[0015]
【附圖說明】
[0016]圖1是本發(fā)明的固定化鐵離子親和層析酶解物的RP-HPLC色譜圖。
[0017]
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0019]一種帶魚魚骨鐵螯合膠原肽的制備方法，制備工藝流程如下:帶魚魚骨〃膠原蛋白提取〃酶解〃酶解物〃超濾〃親和層析"RP-HPLC純化〃鐵螯合膠原肽。
[0020]實(shí)施例:
I)帶魚魚骨的預(yù)處理:將帶魚(CAiwiw1S魚骨按照料液比I g: 20 mL加入到NaOH溶液(0.1 mol/L)于2°C下浸泡4 h，脫除非膠原蛋白；處理后帶魚魚骨用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性、瀝干，按照料液比I g: 8 mL加入pH 7.4的EDTA溶液(0.5 mol/L)，于3°C下浸泡3天(每天更換I次EDTA溶液)，蒸餾水洗3次，干燥、粉碎，得脫鈣帶魚魚骨粉。
[0021]2)帶魚魚骨膠原蛋白的制備:將脫鈣帶魚魚骨粉按照料液比I g:8 mL加入到0.5mol/L乙酸溶液并在4°C下動態(tài)浸泡3 d，10 OOO^離心25 min，取上清液，并加入NaCl至溶液終濃度為1.0 mol/L，靜置90 min, 12 O00^離心30 min得沉淀物，冷凍干燥即為帶