一種快速檢測柑橘半穿刺線蟲的環(huán)等溫擴(kuò)增引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物病原檢測技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種快速檢測柑橘半穿刺線 蟲的環(huán)等溫擴(kuò)增引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在柑橘根圍有多種的植物寄生線蟲，但只有少數(shù)的幾種能對柑橘的產(chǎn)量造成影 響，其中柑橘半穿刺線蟲危害最嚴(yán)重的一種線蟲，每年造成10~30%柑橘產(chǎn)量的損失。柑 橘半穿刺線蟲（tra/75 1)分布廣泛，目前在世界各個主要的柑橘種植 區(qū)域都發(fā)現(xiàn)該種線蟲。在美國，高達(dá)60~90%的柑橘園受到這種線蟲的危害。在國內(nèi)，這 種線蟲危害也非常普遍，如在四川省的柑橘園柑橘半穿刺線蟲的發(fā)病率達(dá)到87. 14%，在云 南省發(fā)病率甚至達(dá)到100%。
[0003] 柑橘半穿刺線蟲危害后會引起柑橘的"慢性衰退病"。這種病的診斷非常困難，因 為該病的癥狀主要是黃化、萎蔫、植株生長緩慢、葉片較小和較少、果實較小和產(chǎn)量下降，這 些癥狀與由于缺水或缺乏營養(yǎng)導(dǎo)致的癥狀類似。目前，準(zhǔn)確的診斷該病的唯一方法就是鑒 定土壤中是否存在柑橘半穿刺線蟲。這就需要進(jìn)行土壤采樣，然后鑒定線蟲種類和測量柑 橘半穿刺線蟲的數(shù)量。
[0004] 然而，目前還主要是通過形態(tài)學(xué)鑒定半穿刺線蟲，但是形態(tài)學(xué)鑒定需要認(rèn)真的觀 察線蟲的形態(tài)和測量線蟲線蟲不同結(jié)構(gòu)的大小，這要求鑒定的人員有多年的線蟲鑒定經(jīng) 驗，專業(yè)要求很高。劉國坤首先開發(fā)出一種通過PCR方法鑒定柑橘半穿刺線蟲的方法；但 是，該方法需要使用昂貴的PCR儀，而且，還需要進(jìn)行電泳檢測，對操作人員的技術(shù)要求較 高，同樣不利于在基層檢測單位中推廣和使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有柑橘半穿刺線蟲檢測技術(shù)的不足，提供一種 安全、簡單、快速、特異性高、敏感性好的檢測柑橘半穿刺線蟲的等溫PCR方法，該方法僅需 要使用恒溫水浴，而且可以通過裸眼觀察直接判斷樣品中是否含有靶標(biāo)的柑橘半穿刺線 蟲。
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測柑橘半穿刺線蟲的環(huán)等溫擴(kuò)增引物。
[0007] 本發(fā)明另一目的是提供上述環(huán)等溫擴(kuò)增引物的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)： 一種快速檢測柑橘半穿刺線蟲的環(huán)等溫擴(kuò)增引物，包括引物對TSF3/ TSB3和引物對 TSFIP/ TSBIP ;引物TSF3的序列如SEQ ID NO. 1所示），引物TSB3的序列如SEQ ID NO. 2 所示，引物TSFIP的序列如SEQ ID NO. 3所示，引物TSBIP的序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0009] 上述環(huán)等溫擴(kuò)增引物在檢測柑橘半穿刺線蟲方面的應(yīng)用或者在制備檢測柑橘半 穿刺線蟲的試劑或試劑盒方面的應(yīng)用，也都應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0010] 一種快速檢測柑橘半穿刺線蟲的環(huán)等溫擴(kuò)增方法，該方法是以樣品DNA為模板， 利用上述引物對TSF3/ TSB3和引物對TSFIP/ TSBIP進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)。
[0011] 所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果的判定方法為：將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，如果出 現(xiàn)特異性階梯狀條帶，則判定樣品中含有柑橘半穿刺線蟲DNA，即為柑橘半穿刺線蟲陽性； 或者向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR green I或鈣黃綠素，如果擴(kuò)增產(chǎn)物由橘紅色變?yōu)闇\綠色，則 判定樣品中含有柑橘半穿刺線蟲DNA，即為柑橘半穿刺線蟲陽性。
[0012] 優(yōu)選地，所述環(huán)等溫擴(kuò)增方法的反應(yīng)體系為：lyL DNA，引物TSFIP和TSBIP各 1. 6 y M，引物 TSF3 和 TSB3 各 0? 2 y M，dNTP 0? 35 y M，2. 5 y L 10 X 似72. 0 DNA 聚合酶緩沖 液，0. 8M甜菜堿，1.5 yL MgS04(100 mM)，l yL 似72. 0 DNA聚合酶，余量ddH20補(bǔ)足，共25 y L〇
[0013] 優(yōu)選地，所述環(huán)等溫擴(kuò)增方法的反應(yīng)條件為：65°C反應(yīng)60min。
[0014] -種快速檢測柑橘半穿刺線蟲的試劑盒，所述試劑盒包括上述引物對TSF3/ TSB3 和引物對TSFIP/ TSBIP。
[0015] 所述試劑盒所使用的檢測方法即為上述環(huán)等溫擴(kuò)增方法。
[0016] 上述環(huán)等溫擴(kuò)增方法或上述試劑盒在檢測柑橘半穿刺線蟲方面的應(yīng)用也都在本 發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0017] 本發(fā)明通過大量的研宄和探索，最終得到的引物對TSF3/ TSB3和引物對TSFIP/ TSBIP配方使用，建立的環(huán)等溫擴(kuò)增方法，不僅能夠非常特異的檢測柑橘半穿刺線蟲，而且 檢測靈敏性達(dá)到了單條，甚至是0. 1條的靈敏度，檢測效果非常好。而且環(huán)等溫擴(kuò)增方法不 需要依賴于任何昂貴的儀器，對實驗檢測人員的要求也很低，是一種安全、簡單、快速、成本 低的檢測方法。
[0018] 本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明提供了一組快速檢測柑橘半穿刺線蟲的環(huán)等溫擴(kuò)增引物。所述引物特異性強(qiáng)、 靈敏度好、且具有很好的重復(fù)性。本發(fā)明利用所述引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)檢測柑橘 半穿刺線蟲，檢測靈敏性達(dá)到了單條，甚至是0. 1條的靈敏度。
[0019] 本發(fā)明僅需使用簡單的恒溫儀器就能完成全部的檢測，不需要依賴于任何昂貴的 儀器，并且檢測時間僅為60min，比普通的RT-PCR提前了 2~3h，簡單快速、對環(huán)境要求低、 無需大型儀器，非常適合在基層檢測單位中使用。
[0020] 另外，本方法檢測結(jié)果的判定方法多樣，可根據(jù)實際情況進(jìn)行選擇。本方法還可以 實現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果的可視化，準(zhǔn)確可靠，無需電泳檢測，不使用溴化乙錠，保障了工作人員 的安全，為柑橘半穿刺線蟲的檢測，尤其是檢驗檢疫工作提供了技術(shù)支持，具有非常好的推 廣應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0021] 圖1為不同退火溫度對擴(kuò)增效率的影響。
[0022] 圖2為反應(yīng)時間與LAMP產(chǎn)物的量的關(guān)系；圖中100、80、50、10、1和0.1表示使用 的0嫩來自于100、80、50、10、1和0.1條柑橘半穿刺線蟲，0(表示使用滅菌水作為模板；圖 中Y軸為熒光強(qiáng)度，X軸為反應(yīng)的循環(huán)數(shù)，每個循環(huán)為2min。
[0023] 圖3為LAMP檢測柑橘半穿刺線蟲的電泳檢測圖；圖中0. 1、1、10和100表示使用 的DNA來自于0. 1、1、10和100條柑橘半穿刺線蟲，CK表示使用滅菌水作為模板，M為DNA 分子量marker。
[0024] 圖4為LAMP檢測柑橘半穿刺線蟲的可視化檢測效果圖；圖中0. 1、1、10和100表 示使用的DNA來自于0. 1、1、10和100條柑橘半穿刺線蟲，CK表示使用滅菌水作為模板。
[0025] 圖5為LAMP檢測柑橘半穿刺線蟲的特異性；圖中1~5為不同種群的柑橘半穿刺 線蟲，6~21為非靶標(biāo)線蟲(具體種類見表1)，22為陰性對照。
【具體實施方式】
[0026] 以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試 劑、方法和設(shè)備。
[0027] 除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。
[0028] 本發(fā)明所述的"0. 1條柑橘半穿刺線蟲的DNA模板"是指用1條線蟲提取的DNA稀 釋10倍后的DNA模板。其中用1條線蟲提取DNA的方法采用Subbotin et al. (2008)所 述方法進(jìn)行。
[0029] 實施例1引物的設(shè)計 根據(jù)NCBI中柑橘半穿刺線蟲的ITS DNA序列（基因登錄號為：FJ969705、⑶433381 JN112270、JN112269、⑶433403、⑶433405 )設(shè)計引物，引物設(shè)計使用軟件 PRMEREXPLORER v. 4 software (http://primerexplorer. jp)進(jìn)行。
[0030] 設(shè)計的引物及其序列如下： TSF3 (如 SEQ ID NO. 1 所示）： GCATCTGGCGAGTCTGTG。
[0031] TSB3 (如 SEQ ID NO. 2 所示）： GCACCGAATCTGGAACTCAT 〇
[0032] TSFIP (如 SEQ ID NO. 3 所示）： CRGGTAAGAGCCGAgaAGGACAggatccGTCATACTTCCTCTgcCGCT。
[0033] TSBIP (如 SEQ ID NO. 4 所示）： TGTAACGCTGAGCgaCTGTTGAttttttGCGACATGTGGAGAAGGC〇
[0034] 實施例2引物反應(yīng)條件優(yōu)化 1、反應(yīng)溫度（引物退火溫度）優(yōu)化 使用柑橘半穿刺線蟲