通過質(zhì)譜法定量甲狀腺球蛋白的制作方法
【專利說明】通過質(zhì)譜法定量甲狀腺球蛋白
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002] 本申請(qǐng)根據(jù)《美國(guó)法典》第35卷第119節(jié)第五款（35U.S.C. § 119(e))的規(guī)定要 求2012年9月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)：61/703,721的權(quán)益，其全部?jī)?nèi)容通過引 用并入本發(fā)明。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及甲狀腺球蛋白的定量。在特定方面，本發(fā)明涉及通過質(zhì)譜法定量甲狀 腺球蛋白的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 本公開背景的以下描述僅僅作為理解本發(fā)明的輔助而提供，且不認(rèn)為對(duì)本發(fā)明描 述或構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。
[0006] 甲狀腺球蛋白或Tg是分子量為660kDa的大二聚體分泌性糖蛋白，其由非共價(jià)結(jié) 合的同型二聚體組成。
[0007]Tg分子以幾種形式存在。在UniProtKnowledgebase(Swiss-Prot+TrEMBL)找到 的三種主要的Tg分子序列是P01266(人甲狀腺球蛋白前體）、P01266-2 (P01266的同種型 2)和Q59GF02(人甲狀腺球蛋白變體）（分別參見圖1、2和3)。
[0008] P01266是P01266的主要變體，其長(zhǎng)度為2768個(gè)AA;P01266-2是P01266的同種 型，其長(zhǎng)度為2711個(gè)AA。P01266-2與P01266在Tg的1510至1567位氨基酸不同；Q59GF0 是甲狀腺球蛋白片段，其長(zhǎng)度為1574個(gè)AA。Q59GF0包含Tg的1212至2768位的氨基酸。
[0009] Tg只能在甲狀腺中產(chǎn)生，可由正常良好分化的良性甲狀腺細(xì)胞或甲狀腺癌細(xì)胞產(chǎn) 生。其為用于甲狀腺激素合成的前體蛋白，并充當(dāng)甲狀腺碘儲(chǔ)存的基質(zhì)。Tg由甲狀腺用來 產(chǎn)生甲狀腺激素甲狀腺素（T4)和三碘甲腺原氨酸（T3)。血液中的Tg水平可用作分化型甲 狀腺癌〇)TC)的腫瘤標(biāo)志物。血液中高水平的Tg并非單獨(dú)為甲狀腺癌的指示物，而是在甲 狀腺手術(shù)切除之后Tg在血液內(nèi)的存留指示甲狀腺組織的存留。在甲狀腺手術(shù)切除之后檢 測(cè)血液中Tg后的治療過程可包括施用放射性碘以切除所有剩余的正常甲狀腺。切除所有 正常甲狀腺之后血液中Tg的繼續(xù)存留可指示仍然存在一定量的腫瘤。
[0010] 已經(jīng)開發(fā)了幾種定量Tg的方法。例如Spencer,et al.,Thyroid, 1999, 9 (5) :435-41andPersoon,etal.,ClinicalChem 2006, 52(4) :686-691公開免疫測(cè)定法、放射性免疫測(cè)定法、以及免疫化學(xué)發(fā)光分析法用于 定量Tg。這些方法均面臨方法學(xué)問題，如標(biāo)準(zhǔn)化的不同、批間分析靈敏度和精確度的變化 性、鉤狀效應(yīng)和由Tg抗體造成的干擾。由Tg抗體造成的干擾問題尤其對(duì)監(jiān)測(cè)Tg水平作為 腫瘤標(biāo)志物的臨床應(yīng)用造成困難，因?yàn)楦哌_(dá)20%的甲狀腺癌患者具有Tg自身抗體。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 本發(fā)明提供通過包括串聯(lián)質(zhì)譜法的質(zhì)譜法定量樣品中Tg的方法。
[0013] -方面，提供確定試樣中Tg的量的方法，包括：（a)對(duì)含Tg的試樣進(jìn)行消化，引起 Tg肽的產(chǎn)生；(b)純化一種或多種Tg肽；（c)電離一種或多種Tg肽；（d)通過質(zhì)譜法檢測(cè) Tg肽離子（一種或多種）的量；和（e)使所檢測(cè)的Tg肽離子（一種或多種）的量與試樣 中Tg的量相關(guān)聯(lián)。制備Tg肽的優(yōu)選的酶為胰蛋白酶。用于該方法的合適的Tg肽為可通 過質(zhì)譜法評(píng)價(jià)且可從可由除了Tg之外的蛋白質(zhì)生成的有關(guān)肽中充分純化的Tg肽。一種這 樣的肽的示例為肽T129 (序列VIFDANAPVAVR;SEQIDNO:1)，其包含Tg第1579至1590位 的氨基酸，分子量為大約1，270Da，且在Tg的所有三種同種型中存在。參見圖4。
[0014] 肽T129的形成提供了針對(duì)甲狀腺球蛋白特有的胰蛋白酶生成肽。并且，從Tg的 胰蛋白酶消化而產(chǎn)生肽T129應(yīng)當(dāng)不受Tg抗體存在或不存在的影響。因此，測(cè)量試樣中肽 T129的增加提供定量試樣中初始Tg的量而不受Tg抗體干擾影響的方法。
[0015] 可使用任何合適的方法確定由樣品中Tg消化引起的Tg肽的量。在試樣可包含內(nèi) 源Tg肽的情況下，可采取步驟確保內(nèi)源肽不與通過消化樣品中Tg生成的肽相混淆。一種 途徑是在消化Tg之前從樣品中去除內(nèi)源Tg肽。其可例如利用尺寸分離技術(shù)完成。另一種 途徑是根據(jù)本發(fā)明要求保護(hù)的方法分析部分試樣，但除去消化步驟，從而建立試樣中內(nèi)源 肽的基準(zhǔn)水平。在這種途徑中，一旦確定基準(zhǔn)，其可從消化后的肽水平中減去，消化后的肽 水平表示內(nèi)源肽和消化生成的肽。
[0016]由于該方法可應(yīng)用于復(fù)雜的試樣（尤其是體液或源自組織的試樣），可采取步驟 在消化之前純化試樣中的Tg。這可例如利用尺寸分離技術(shù)完成。
[0017] 在一些實(shí)施方式中，方法包括生成一種或多種Tg肽離子，其中至少一種該離子 具有與（帶單電荷或多電荷的）肽T129離子的質(zhì)荷比（m/z)相當(dāng)?shù)馁|(zhì)荷比。在優(yōu)選的 相關(guān)實(shí)施方式中，方法包括生成一種或多種Tg肽離子，其中至少一種具有1272. 8±0. 5、 636. 4±0. 5、或424. 3±0. 5的m/z(相當(dāng)于帶單電荷、雙電荷或三電荷的肽T129離子）。在 相關(guān)的優(yōu)選實(shí)施方式中，方法可包括生成Tg肽離子的一種或多種碎片離子，其中至少一種 具有 541. 3±0. 5、612. 3±0. 5、726. 4±0. 5、797. 4±0. 5、912. 4±0. 5 或 1059. 5±0. 5 的m/ z;優(yōu)選地，該碎片離子的一種或多種選自具有797. 4±0. 5、912. 4±0. 5和1059. 5±0. 5的 m/z的離子。
[0018] 在一些實(shí)施方式中，步驟（b)中的純化使用至少一種尺寸分離技術(shù)完成。優(yōu)選地， 尺寸分離技術(shù)可以是過濾、LC或其任何組合。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，試樣為體液或組織。 在一些實(shí)施方式中，包括額外的步驟，其中對(duì)第二量的試樣進(jìn)行步驟（b)至（e)，從而建立 一種或多種內(nèi)源Tg肽的基準(zhǔn)水平。在這些實(shí)施方式中，該基準(zhǔn)水平可從在試樣中檢測(cè)的Tg 肽離子（一種或多種）的量中減去，以確定由原始試樣中的Tg產(chǎn)生的Tg肽離子的量。在其 它實(shí)施方式中，方法包括在消化之前純化試樣中Tg的額外初始步驟。在這些實(shí)施方式中， 消化前純化和/或步驟（b)中的純化可各自使用至少一種尺寸分離技術(shù)完成。優(yōu)選地，在 消化前純化和步驟（b)中均使用的至少一種尺寸分離技術(shù)是過濾；更優(yōu)選地，該過濾利用 具有分子量截止的分子量截止過濾器完成，該過濾器使得Tg保留在過濾器的上方，并使得 Tg肽跟隨濾液通過。在相關(guān)實(shí)施方式中，分子量截止為大約2kD至300kD;更加優(yōu)選地為大 約100kD至300kD。在這些實(shí)施方式中，兩種過濾（預(yù)消化和步驟（b))可利用相同的過濾 器進(jìn)行。
[0019] 在第二個(gè)方面，提供確定試樣中Tg的量的方法，包括：（a)對(duì)含Tg的試樣進(jìn)行消 化，引起肽T129的產(chǎn)生；(b)純化肽T129 ; (c)電離肽T129以生成具有636. 4±0. 5的m/z 的前體離子；（d)使肽T129前體離子碎裂，以形成一種或多種碎片離子，其中至少一種具有 大約797. 4±0. 5、912. 4±0. 5或1059. 5±0. 5的m/z;通過質(zhì)譜法檢測(cè)肽T129前體離子、一種或多種碎片離子、或二者的量；和（e)將所檢測(cè)的離子（一種或多種）的量與試樣中Tg 的量相關(guān)聯(lián)。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，試樣為體液或組織。在一些實(shí)施方式中，包括額外的 步驟，其中對(duì)第二量的試樣進(jìn)行步驟（b)至（e)，從而建立一種或多種內(nèi)源肽T129的基準(zhǔn)水 平。在這些實(shí)施方式中，該基準(zhǔn)水平可從在試樣中檢測(cè)的肽T129離子（一種或多種）的量 中減去，以確定由原始試樣中的Tg產(chǎn)生的肽T129離子（一種或多種）的量。在其它實(shí)施 方式中，方法包括在消化之前純化試樣中Tg的額外初始步驟。在這些實(shí)施方式中，預(yù)消化 純化和/或步驟（b)中的純化可各自利用至少一種尺寸分離技術(shù)完成。優(yōu)選地，在預(yù)消化 純化和步驟（b)中均使用的至少一個(gè)尺寸分離技術(shù)為過濾；更優(yōu)選地，該過濾利用具有分 子量截止的分子量截止過濾器完成，該過濾器使得Tg保留在過濾器的上方，并使得Tg肽跟 隨濾液通過。在相關(guān)實(shí)施方式中，分子量截止為大約2kD至300kD;更優(yōu)選地為大約100kD 至300kD。在這些實(shí)施方式中，兩種過濾（預(yù)消化和步驟（b))可利用相同的過濾器進(jìn)行。
[0020] 如本文使用的，術(shù)語"純化（purification) "或"純化（purifying) "不是指除感 興趣分析物（一種或多種）之外將所有物質(zhì)從樣品中去除。相反，純化是指相對(duì)于樣品的 一種或多種其它組分富集感興趣的一種或多種分析物的量的過程。本文使用的純化不需要 使分析物從所有其它物質(zhì)中分離。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，純化步驟或過程可用于去除一種 或多種干擾物質(zhì)，例如一種或多種將干擾該方法中使用的儀器運(yùn)行的物質(zhì)或可干擾通過質(zhì) 譜法檢測(cè)分析物離子的物質(zhì)。
[0021] 如本文使用的，與不包含測(cè)量離子質(zhì)量的定量測(cè)量有關(guān)的術(shù)語"大約"是指指示值 加上或減去10%。
[0022] 如本文使用的，術(shù)語"基本上所有的"是指任何大于50%、更優(yōu)選地大于60%、更 優(yōu)選地大于70%、更優(yōu)選地大于80%、和更優(yōu)選地大于90