用于控制基因表達(dá)的單鏈核酸分子的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)是中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)201180027223. 1的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2011年 07月08日，發(fā)明名稱(chēng)為用于控制基因表達(dá)的單鏈核酸分子。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及抑制基因表達(dá)的單鏈核酸分子、包含該單鏈核酸分子的組合物及其用 途。
【背景技術(shù)】
[0003] 作為抑制基因表達(dá)的技術(shù)，例如，已知RNA干擾（RNAi)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。基于RNA 干擾的基因的表達(dá)抑制通常通過(guò)例如在細(xì)胞等中投與短的雙鏈RNA分子來(lái)實(shí)施。上述雙鏈 RNA分子通常被稱(chēng)為siRNA(小干擾RNA)。除此之外，還報(bào)道了一種環(huán)狀的RNA分子，該RNA 分子通過(guò)分子內(nèi)退火而部分地形成了雙鏈，利用該RNA分子也能夠抑制基因表達(dá)（專(zhuān)利文 獻(xiàn)1)。但是，這些方法中，誘導(dǎo)基因的表達(dá)抑制的RNA分子存在以下問(wèn)題。
[0004] 首先，在制造上述SiRNA的情況下，需要以下工序：在分別合成正義鏈和反義鏈之 后，最后將這些鏈雜交。因此，存在制造效率差的問(wèn)題。另外，在細(xì)胞中投與上述siRNA時(shí)， 需要以抑制了其解離為單鏈RNA的狀態(tài)投與至細(xì)胞中，因而，其操作條件的設(shè)定也需要?jiǎng)?力。接著，在為環(huán)狀的RNA分子的情況下，存在難以合成的問(wèn)題。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006] 專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0007] 專(zhuān)利文獻(xiàn)1 :日本特開(kāi)2008-278784 [0008] 非專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0009]非專(zhuān)利文獻(xiàn) 1:Fire等、Nature第 391 卷，p. 806-811，1998 年
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 因此，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠抑制基因表達(dá)的新的、能夠容易且高效地 制造的核酸分子。
[0011] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的單鏈核酸分子的特征在于，其為包含抑制靶基因表 達(dá)的表達(dá)抑制序列的單鏈核酸分子，
[0012] 從5'側(cè)至3'側(cè)依次包含5'偵慪域（Xc)、內(nèi)部區(qū)域⑵以及3'偵慪域（Yc)，
[0013] 上述內(nèi)部區(qū)域（Z)由內(nèi)部5'側(cè)區(qū)域（X)和內(nèi)部3'側(cè)區(qū)域（Y)連結(jié)而構(gòu)成，
[0014] 上述5'側(cè)區(qū)域（Xc)與上述內(nèi)部5'側(cè)區(qū)域⑴互補(bǔ)，
[0015] 上述3'側(cè)區(qū)域（Yc)與上述內(nèi)部3'側(cè)區(qū)域⑴互補(bǔ)，
[0016]上述內(nèi)部區(qū)域（Z)、上述5'側(cè)區(qū)域（Xc)以及上述3'側(cè)區(qū)域（Yc)中的至少一者包 含上述表達(dá)抑制序列。
[0017] 本發(fā)明的組合物的特征在于，其為用于抑制靶基因表達(dá)的組合物，其包含上述本 發(fā)明的單鏈核酸分子。
[0018] 本發(fā)明的組合物的特征在于，其為藥學(xué)組合物，其包含上述本發(fā)明的單鏈核酸分 子。
[0019] 本發(fā)明的表達(dá)抑制方法的特征在于，其為抑制靶基因表達(dá)的方法，其使用上述本 發(fā)明的單鏈核酸分子。
[0020] 本發(fā)明的疾病的治療方法的特征在于，其包括將上述本發(fā)明的單鏈核酸分子投與 至患者的工序，上述單鏈核酸分子具有抑制成為上述疾病的原因的基因的表達(dá)的序列作為 上述表達(dá)抑制序列。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的單鏈核酸分子，能夠進(jìn)行基因的表達(dá)抑制，并且由于不是環(huán)狀，因而 其合成容易，另外，由于是單鏈，因此不存在雙鏈的退火工序，能夠高效地制造。
[0022] 需要說(shuō)明的是，本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的單鏈核酸分子的結(jié)構(gòu)能夠抑制基因 表達(dá)。本發(fā)明的單鏈核酸分子的基因的表達(dá)抑制效果被推測(cè)是與基于RNA干擾同樣的現(xiàn) 象，但本發(fā)明中的基因表達(dá)抑制不限制和限定于RNA干擾。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1是示出本發(fā)明的單鏈核酸分子的一例的示意圖。
[0024] 圖2是示出本發(fā)明的單鏈核酸分子的其他例子的示意圖。
[0025] 圖3是示出本發(fā)明的單鏈核酸分子的其他例子的示意圖。
[0026] 圖4是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的GAPDH基因表達(dá)量的相對(duì)值的圖表。
[0027] 圖5是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的GAPDH基因表達(dá)量的相對(duì)值的圖表。
[0028] 圖6是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的A549細(xì)胞的GAPDH基因表達(dá)量的相對(duì)值的圖表。
[0029] 圖7是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的293細(xì)胞的GAPDH基因表達(dá)量的相對(duì)值的圖表。
[0030] 圖8是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的TGF-M基因表達(dá)量的相對(duì)值的圖表。
[0031] 圖9是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的各投與組中單位重量的肺的TGF-M基因表達(dá)量 的圖表。
[0032] 圖10是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的各投與組中的BAFL樣品中的細(xì)胞數(shù)的圖表。
[0033] 圖11是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的各投與組中的BALF樣品中的中性粒細(xì)胞的細(xì)胞 數(shù)的圖表。
[0034] 圖12是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的BALF樣品中的細(xì)胞的吉姆薩染色結(jié)果的照片， 圖12的（A)示出LPS(+)/RNA㈠的投與組4的結(jié)果，圖12的⑶示出LPS(+)/陰性對(duì)照 NK-0035(+)的投與組6的結(jié)果，圖12的（C)示出LPS(+)/NK-0033(+)的實(shí)施例投與組5的 結(jié)果。
[0035] 圖13是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的肺組織的HE染色結(jié)果的照片，圖13的（A)示出 LPS(+)/RNA(_)的投與組4的結(jié)果，圖13的（B)示出LPS(+)/陰性對(duì)照NK-0035(+)的投與 組6的結(jié)果，圖13的（C)示出LPS(+)/NK-0033(+)的實(shí)施例投與組5的結(jié)果。
[0036] 圖14的（A)示出本發(fā)明的實(shí)施例中的TGF-M基因的表達(dá)量的結(jié)果，圖14的（B) 示出本發(fā)明的實(shí)施例中的IFN-a基因的表達(dá)量的結(jié)果，圖14的（C)示出本發(fā)明的實(shí)施例 中的IFN-0基因的表達(dá)量的結(jié)果。
[0037] 圖15是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的TGF-M基因表達(dá)量的相對(duì)值的圖表。
[0038] 圖16是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的TGF-M基因表達(dá)量的相對(duì)值的圖表。
[0039] 圖17是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的各投與組中單位重量的肺的TGF-M表達(dá)量的 圖表。
[0040] 圖18的（A)是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的各投與組的BALF樣品中的TNF-a量的圖 表，圖18的（B)是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的各投與組的BALF樣品中的IFN-0量的圖表。
[0041] 圖19是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的293細(xì)胞的LAMA基因的表達(dá)量的相對(duì)值的圖 表。
[0042] 圖20是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的A549細(xì)胞的LMNA基因的表達(dá)量的相對(duì)值的圖 表。
[0043] 圖21是示出本發(fā)明的實(shí)施例中使用的ssRNA的圖。
[0044] 圖22是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的GAPDH基因表達(dá)量的相對(duì)值的圖表。
[0045] 圖23是示出本發(fā)明的實(shí)施例中使用的ssRNA的圖。
[0046] 圖24是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的GAPDH基因表達(dá)量的相對(duì)值的圖表。
[0047] 圖25是示出本發(fā)明的實(shí)施例中使用的ssRNA的圖。
[0048] 圖26是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的GAPDH基因表達(dá)量的相對(duì)值的圖表。
[0049] 圖27是示出本發(fā)明的實(shí)施例中使用的ssRNA的圖。
[0050] 圖28是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的GAPDH基因表達(dá)量的相對(duì)值的圖表。
[0051] 圖29是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的GAPDH基因表達(dá)量的相對(duì)值的圖表。
[0052] 圖30是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的HCT116細(xì)胞的GAPDH基因表達(dá)量的相對(duì)值的圖 表。
[0053] 圖31是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的核糖核酸酶耐受性的電泳照片。
[0054] 圖32是示出本發(fā)明的實(shí)施例中的S7核酸酶耐受性的電泳照片。
【具體實(shí)施方式】
[0055] 只要沒(méi)有特別提及，則本說(shuō)明書(shū)中使用的用語(yǔ)能夠以該技術(shù)領(lǐng)域中通常所用的含 義使用。
[0056] LssNc分子
[0057] 如上所述，本發(fā)明的單鏈核酸分子的特征在于，其為包含抑制靶基因表達(dá)的表達(dá) 抑制序列的單鏈核酸分子，
[0058] 從5'側(cè)至3'側(cè)依次包含5'側(cè)區(qū)域（Xc)、內(nèi)部區(qū)域⑵以及3'側(cè)區(qū)域（Yc)，
[0059] 上述內(nèi)部區(qū)域（Z)由內(nèi)部5'側(cè)區(qū)域（X)和內(nèi)部3'側(cè)區(qū)域（Y)連結(jié)而構(gòu)成，
[0060] 上述5'側(cè)區(qū)域（Xc)與上述內(nèi)部5'側(cè)區(qū)域⑴互補(bǔ)，
[0061] 上述3'側(cè)區(qū)域（Yc)與上述內(nèi)部3'側(cè)區(qū)域⑴互補(bǔ)，
[0062]上述內(nèi)部區(qū)域（Z)、上述5'側(cè)區(qū)域（Xc)以及上述3'側(cè)區(qū)域（Yc)的至少一者包含 上述表達(dá)抑制序列。
[0063] 本發(fā)明中，"靶基因的表達(dá)抑制"例如是指阻礙上述靶基因的表達(dá)。上述抑制的機(jī) 理沒(méi)有特別限制，例如，可以為下降調(diào)節(jié)或沉默。上述靶基因的表達(dá)抑制能夠通過(guò)例如由上 述靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生成量的減少、上述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的活性的減少、由上述靶基因的翻譯 產(chǎn)物的生成量的減少或者上述翻譯產(chǎn)物的活性的減少等來(lái)確認(rèn)。上述蛋白質(zhì)可以舉出例如 成熟蛋白或者接受加工或翻譯后修飾之前的前體蛋白。
[0064] 以下，將本發(fā)明的單鏈核酸分子也稱(chēng)為本發(fā)明的"ssNc分子"。本發(fā)明的ssNc分子 例如在體內(nèi)（invivo)或體外（invitro)中能夠用于革E1基因的表達(dá)抑制，因而也稱(chēng)為"革巴 基因的表達(dá)抑制用ssNc分子"或"靶基因的表達(dá)抑制劑"。另外，本發(fā)明的ssNc分子例如 通過(guò)RNA干擾而能夠抑制上述靶基因的表達(dá)，因而也稱(chēng)為"RNA干擾用ssNc分子"、"RNA干 擾誘導(dǎo)分子"、"RNA干擾劑"或"RNA干擾誘導(dǎo)劑"。另外，本發(fā)明的ssNc分子能夠抑制例如 干擾素誘導(dǎo)等副作用。
[0065] 本發(fā)明的ssNc分子的5'末端和3'末端未連結(jié)，還能夠稱(chēng)為線(xiàn)狀單鏈核酸分子。 本發(fā)明的ssNc分子例如在上述內(nèi)部區(qū)域（Z)中，上述內(nèi)部5'區(qū)域（X)和上述內(nèi)部3'區(qū)域 (Y)直接連結(jié)。
[0066] 本發(fā)明的ssNc分子中，上述5'側(cè)區(qū)域（Xc)與上述內(nèi)部5'側(cè)區(qū)域⑴互補(bǔ)，上述 3'側(cè)區(qū)域（Yc)與上述內(nèi)部3'側(cè)區(qū)域⑴互補(bǔ)。因此，對(duì)于5'側(cè)而言，上述區(qū)域（Xc)向上 述區(qū)域（X)折回，上述區(qū)域（Xc)與上述區(qū)域（X)能夠通過(guò)自退火形成雙鏈，另外，在3'側(cè)， 上述區(qū)域（Yc)向上述區(qū)域（Y)折回，上述區(qū)域（Yc)與上述區(qū)域（Y)能夠通過(guò)自退火形成 雙鏈。本發(fā)明的ssNc分子能夠這樣地在分子內(nèi)形成雙鏈，例如，與以往的RNA干擾中使用 的siRNA那樣的、由分離的兩條單鏈RNA通過(guò)退火形成的雙鏈RNA是明顯不同的結(jié)構(gòu)。
[0067] 在本發(fā)明的ssNc分子中，例如，本發(fā)明的ssNc分子以體內(nèi)或體外的方式導(dǎo)入到 細(xì)胞內(nèi)的情況下，上述表達(dá)抑制序列為顯示抑制上述靶基因的表達(dá)的活性的序列。上述 表達(dá)抑制序列沒(méi)有特別限制，能夠根據(jù)目標(biāo)靶基因的種類(lèi)適宜設(shè)定。上述表達(dá)抑制序列例 如能夠適宜適用基于siRNA的RNA干擾的相關(guān)序列。RNA干擾通常為下述現(xiàn)象：長(zhǎng)的雙鏈 RNA(dsRNA)在細(xì)胞內(nèi)被切酶切斷成3'末端突出的19~21堿基對(duì)左右的雙鏈RNA(siRNA: 小干擾RNA)，其中一個(gè)單鏈RNA與靶mRNA結(jié)合，分解上述mRNA，由此抑制上述mRNA的翻譯。 與上述靶mRNA結(jié)合的上述siRNA中的單鏈RNA的序列例如根據(jù)靶基因的種類(lèi)被報(bào)道了各 種種類(lèi)。本發(fā)明可以使用例如上述siRNA的單鏈RNA的序列作為上述表達(dá)抑制序列。
[0068] 需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的關(guān)鍵點(diǎn)不在于對(duì)于上述靶基因的上述表達(dá)抑制序列的序 列信息，而是涉及用于在例如細(xì)胞內(nèi)使上述表達(dá)抑制序列所產(chǎn)生的上述靶基因的表達(dá)抑制 活性發(fā)揮功能的核酸分子的結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明中，例如，除了申請(qǐng)時(shí)公知的上述siRNA的 單鏈RNA序列之外，還能夠利用將來(lái)所獲知的序列作為上述表達(dá)抑制序列。
[0069] 上述表達(dá)抑制序列例如相對(duì)于上述靶基因的規(guī)定區(qū)域優(yōu)選具有90%以上的互補(bǔ) 性、更優(yōu)選為95%、進(jìn)一步優(yōu)選為98%、特別優(yōu)選為100%。通過(guò)滿(mǎn)足這樣的互補(bǔ)性，例如， 能夠充分減輕脫靶。
[0070] 作為具體例，在靶基因?yàn)镚APDH基因的情況下，上述表達(dá)抑制序列能夠使用例如 序列號(hào)1所示的19堿基長(zhǎng)的序列；在靶基因?yàn)門(mén)GF-M的情況下，上述表達(dá)抑制序列能夠 使用例如序列號(hào)16所不的21喊基長(zhǎng)的序列；在革E1基因?yàn)長(zhǎng)AMA1基因的情況下，上述表達(dá)抑 制序列能夠使用例如序列號(hào)5所不的19喊基長(zhǎng)的序列；在革E1基因?yàn)長(zhǎng)MNA基因的情況下，能 夠使用例如序列號(hào)6所不的19喊基長(zhǎng)的序列。
[0071] 5' -GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3'（序列號(hào) 1)
[0072] 5' -AAAGUCAAUG