高產(chǎn)纖維素酶工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種產(chǎn)酶工程菌及其應(yīng)用，具體涉及一種高產(chǎn)纖維素酶工程菌及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素酶是一類能夠降解纖維素，使之生成纖維二糖和葡萄糖等一系列酶的總 稱，按各酶功能的不同可以分為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶三大類， 在協(xié)同作用下它們可以將纖維素物質(zhì)徹底水解成葡萄糖，進(jìn)而發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，解決能源再 生以及環(huán)境污染等問題。目前，纖維素酶成本高及酶活力低嚴(yán)重制約其在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng) 用。為解決這個問題，一方面需要篩選高產(chǎn)量和高酶活力的纖維素酶產(chǎn)生菌，另一方面就 是通過現(xiàn)代的基因工程手段，構(gòu)建高效表達(dá)的基因工程菌，或通過對已知的纖維素酶進(jìn)行 分子改造以提高其比活力。由于篩選原始菌株工作量大，且產(chǎn)量一般情況下較基因工程菌 低，所以構(gòu)建高效表達(dá)的基因工程菌是降低纖維素酶成本、提高產(chǎn)量的有效手段，因此，研 宄構(gòu)建高效表達(dá)纖維素酶的基因工程菌具有重要意義。
[0003] CN103865949A(公開日為2014年06月18日）公開了一種基因敲除選育纖維素 酶高產(chǎn)菌株的方法，本發(fā)明基因敲除選育纖維素酶高產(chǎn)菌株的方法為敲除纖維素酶生產(chǎn)菌 株的淀粉酶基因，其中，一種纖維素酶高產(chǎn)菌株為敲除淀粉酶基因的黑曲霉，通過將重組片 段淀粉酶基因的前半部分-潮霉素B抗性基因表達(dá)單元-淀粉酶基因的后半部分連接到 PCAMBIA1300質(zhì)粒上得到淀粉酶基因敲除質(zhì)粒，再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，通過農(nóng)桿介導(dǎo)轉(zhuǎn)化 黑曲霉敲除淀粉酶基因。本發(fā)明利用基因敲除技術(shù)，敲掉黑曲霉的淀粉酶基因，敲出淀粉酶 基因后，細(xì)胞負(fù)荷減少，從而有利于產(chǎn)生纖維素酶，得到的纖維素酶菌株的纖維素酶活性為 21U/g〇
[0004] 雖然上述現(xiàn)有技術(shù)公開了一些纖維素酶高產(chǎn)菌株的培育方法，能夠滿足一定的需 要，但這些仍存在一定的缺陷：工程菌的纖維素酶產(chǎn)量相對較低，不適合在工業(yè)中大規(guī)模 生產(chǎn)使用。
[0005] 因此，對于現(xiàn)有纖維素酶工程菌存在進(jìn)一步的改進(jìn)和優(yōu)化需求，這也是該技術(shù)領(lǐng) 域內(nèi)的研宄熱點(diǎn)和重點(diǎn)之一，更是本發(fā)明得以完成的動力和出發(fā)點(diǎn)所在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述技術(shù)問題，本發(fā)明人在進(jìn)行了大量的深入研宄之 后，從而完成了本發(fā)明。
[0007] 本發(fā)明涉及兩個方面，具體而言，涉及一種高產(chǎn)纖維素酶工程菌及其應(yīng)用。
[0008] 第一方面，本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)纖維素酶工程菌，所述高產(chǎn)纖維素酶工程菌通過 以下步驟制備：
[0009] 步驟一，重組片段的合成
[0010] SEQ ID NO. 1所示的重組片段由SEQ ID NO. 2所示的淀粉酶基因的前半部分、SEQ ID NO. 3所示的潮霉素B抗性基因表達(dá)單元、SEQ ID NO. 4所示的淀粉酶基因的后半部分組 成，所述重組片段用Ncol酶液在32. 3-33. 4°C條件下進(jìn)行酶切；
[0011] 步驟二，將PCAMBIA1300質(zhì)粒用Ncol酶進(jìn)行酶切；
[0012] 步驟三，將酶切后的所述重組片段和所述質(zhì)粒通過DNA連接酶連接得到淀粉酶基 因敲除質(zhì)粒pCAMBIA1300-gh;
[0013] 步驟四，用所述淀粉酶基因敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌；
[0014] 步驟五，將黑曲霉和含有淀粉酶基因敲除質(zhì)粒的農(nóng)桿菌混合培養(yǎng)，通過潮霉素B 抗性篩選得到敲除淀粉酶基因的黑曲霉，即得。
[0015] 優(yōu)選的，步驟一中，用Ncol酶液在32. 8°C條件下進(jìn)行酶切。
[0016] 更優(yōu)選的，步驟一中，用Ncol酶液在32. 8°C條件下進(jìn)行酶切16小時(shí)。
[0017] 第二方面，本發(fā)明涉及一種上述高產(chǎn)纖維素酶工程菌在制備纖維素酶中的應(yīng)用。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：【背景技術(shù)】中CN103865949A中通過基因 敲除技術(shù)得到纖維素酶工程菌株的活性為21U/g，本發(fā)明的對比例中纖維素酶工程菌株的 酶活也在21U/g左右，而本發(fā)明的實(shí)施例中維素酶工程菌株的活性在32U/g以上，與現(xiàn)有技 術(shù)和對比例相比，本發(fā)明提供的纖維素酶工程菌的酶活提高了 40%以上，顯著提高了纖維 素酶的產(chǎn)量，適合在工業(yè)中大規(guī)模生產(chǎn)使用。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0020] 本發(fā)明的實(shí)施例1-3涉及一種高產(chǎn)纖維素酶工程菌的構(gòu)建，均由以下步驟組成：
[0021] A、淀粉酶基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建
[0022] (1)重組片段的合成
[0023] 重組片段由淀粉酶基因的前半部分（SEQ ID N0.2)，潮霉素B抗性基因表達(dá)單 元（SEQID NO. 3)，淀粉酶基因的后半部分（SEQ ID N0.4)組成，合成的重組片段（SEQ ID NO. 1)用Ncol酶液2 y L (TakaRa購買），在一定溫度條件下進(jìn)行酶切16h;
[0024] (2)pCAMBIA1300提取及酶切
[0025] 含有pCAMBIA1300質(zhì)粒的大腸桿菌E. coli DH5 a于37°C振蕩培養(yǎng)12h;取1. 5mL 菌體于￡?管，以4000印111離心3111；[11，棄上清液；加0.11111^溶液1(1%葡萄糖，501111￡014口11 8. 0, 25mM Tris-HCl pH 8. 0)充分混合；加入 0? 2mL 溶液 II (0? 2mM NaOH，1 % SDS)，輕輕翻 轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5min ;加入0. 15mL預(yù)冷溶液III (5mol/L KAc，pH4. 8)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，冰 浴5min ;以lOOOOrpm離心20min，取上清液于另一新EP管；加入等體積的異戊醇，混勾后靜 置10min ;再以lOOOOrpm離心20min，棄上清；用70%乙醇0. 5mL洗滌一次，抽干所有液體； 待沉淀干燥后，溶于0. 05mL TE緩沖液中；提取的pCAMBIA1300質(zhì)粒50 y L加入Ncol酶液 2yL(TakaRa 購買），30°C酶切 16h，酶切后 65°C水浴 10min ;
[0026] ⑶連接
[0027]酶切的合成片段100 y L和酶切的質(zhì)粒20 y L用5 y L T4 DNA ligase (TakaRa購 買）l6°c連接24h;
[0028] B、感受態(tài)細(xì)胞制備
[0029] (1)將E.coliDH5a置于LB培養(yǎng)基上，在37°C下過夜培養(yǎng)；
[0030] (2)高溫滅菌大的離心瓶（250-500mL)以備第二天搖瓶用；
[0031] (3)準(zhǔn)備幾瓶滅菌水（總量約1.5升），保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細(xì)胞 用；
[0032] (4)轉(zhuǎn)移0.2-lmL過夜培養(yǎng)物至裝有20mLLB(或其他營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基）的 100mL搖瓶；
[0033] (5) 37°C下劇烈振蕩培養(yǎng)6小時(shí)；
[0034] (6)監(jiān)控0? D. 600值（培養(yǎng)1小時(shí)后每半小時(shí)測定一次）；
[0035] (7)當(dāng)0.D. 600值達(dá)到0. 5-1. 0時(shí)，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻15分鐘；
[0036] (8)細(xì)胞在4°C 5000g下離心15分鐘，棄上清液；
[0037] (9)用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞；先用渦旋儀或吸液管重懸浮細(xì)胞于少量體積中（5 毫升），然后加水稀釋至離心管的2/3體積；
[0038] (10)照上面步驟重復(fù)離心，小心棄去上清液；
[0039] (11)照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞；
[0040] (12)離心，棄上清液；
[0041] (13)用20mL滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細(xì)胞；
[0042] (14)照上面步驟離心，小心棄去上清液（沉淀可能會很松散）；
[0043] (15)用10%甘油重懸浮細(xì)胞至最終體積為2_3mL;
[0044] (16)將細(xì)胞按150 y L等份裝入微量離心管，于-80°C保存；
[0045] C、轉(zhuǎn)化大腸桿菌
[0046] (1)在冰上解凍B步驟制得的感受態(tài)細(xì)胞；
[0047] (2)每100yL感受態(tài)細(xì)胞添加10yL連接的質(zhì)粒，冰上培育約5分鐘；
[0048] (3)