一種微生物轉(zhuǎn)化制備姜黃素糖苷化產(chǎn)物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品和藥品技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種微生物轉(zhuǎn)化制備姜黃素糖苷化產(chǎn)物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]姜黃為姜科姜黃屬植物姜黃(Curcuma longa L.)的干燥根莖，主要用于食品及色素，主產(chǎn)于中國、印度、日本等國家。姜黃素(Curcumin)為其中提取得到的一種具有獨特的1，7_ 二芳基庚酸基本骨架的多酚性色素，是姜黃中主要活性成分之一。由于其色澤穩(wěn)定且毒性很低，被廣泛應(yīng)用于食品添加劑和染料。現(xiàn)代藥理學(xué)研宄證明姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、利膽、抗肝細胞毒性、抗風(fēng)濕、抑菌、抗低血壓、低膽固醇以及抗老年癡呆癥等廣泛的藥理作用。同時由于其在較大劑量情況下對人體安全性仍較高，因此被美國FDA批準(zhǔn)進入了一期臨床試驗，且有望開發(fā)為新型的化學(xué)預(yù)防藥。
[0003]由于姜黃素水溶性差、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，使它在食品和藥品領(lǐng)域中的應(yīng)用受到較大的限制。其在酸性和中性pH環(huán)境中幾乎不溶，只溶于丙酮等少數(shù)有機溶劑，且久置或光照容易分解。因此雖然姜黃素是一種有效的抗癌藥物，但其選擇性低、藥效不持久、被機體吸收的能力差，導(dǎo)致其生物可利用度低，這些不足嚴(yán)重影響了它的臨床應(yīng)用?；诖耍诒３纸S素原有藥效的基礎(chǔ)上合成新的姜黃素衍生物與類似物就成了近期研宄的熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種微生物轉(zhuǎn)化制備姜黃素糖苷化產(chǎn)物的方法，旨在解決姜黃素水溶性差導(dǎo)致的生物利用度低問題。
[0005]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種微生物轉(zhuǎn)化制備姜黃素糖苷化產(chǎn)物的方法，該微生物轉(zhuǎn)化制備姜黃素糖苷化產(chǎn)物的方法包括:
[0006]步驟一，華根霉R.chinensis菌絲生長旺盛時，按照每瓶5-15mg劑量，加入姜黃素底物；
[0007]步驟二，姜黃素底物加入菌液中共培養(yǎng)4-8天后，減壓抽濾除去菌絲，濾液以等體積乙酸乙酯萃取3次，有機相合并，減壓濃縮至干；
[0008]步驟三，殘渣經(jīng)硅膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇100: 1，50:1和10: l，v/v的梯度洗脫，得到產(chǎn)物；
[0009]進一步，步驟一中的華根霉R.chinensis接種于液體PDA培養(yǎng)基，搖床上避光培養(yǎng)24，使微生物大量繁殖。
[0010]進一步，PDA培養(yǎng)基的制備方法:
[0011]取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，置燒杯中加水1.0L煮沸30min，濾除馬鈴薯塊，將葡萄糖20g加入濾液中，攪拌至完全溶解，再補足濾液至1L，自然pH即可，固體斜面培養(yǎng)基另加2.5%瓊脂；
[0012]進一步，該微生物轉(zhuǎn)化制備姜黃素糖苷化產(chǎn)物的方法包括以下步驟:
[0013]步驟一，將菌株在無菌條件下接入培養(yǎng)基中，250mL三角瓶，裝80mL液體培養(yǎng)基，25°C下于180rpm搖床上避光培養(yǎng)；
[0014]步驟二，當(dāng)菌絲生長旺盛時，按照每瓶5_15mg劑量，加入姜黃素底物；
[0015]步驟三，底物加入菌液中共培養(yǎng)4-8天后，減壓抽濾除去菌絲，濾液以等體積乙酸乙酯萃取3次。有機相合并，減壓濃縮至干；
[0016]步驟四，殘渣經(jīng)硅膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇100: 1,50:1和10: l，v/v的梯度洗脫，得到產(chǎn)物。
[0017]進一步，該微生物轉(zhuǎn)化制備姜黃素糖苷化產(chǎn)物的方法包括以下步驟:
[0018]步驟一，將華根霉R.chinensis接種于250mL三角瓶中，每瓶盛80mL液體培養(yǎng)基，25°C下于180rpm搖床上避光培養(yǎng)24h，吸取其中5mL菌液置于100mL三角瓶中，每瓶盛380mL液體培養(yǎng)基，25°C下于180rpm搖床上避光培養(yǎng)；
[0019]步驟二，當(dāng)菌絲生長旺盛時，按照每瓶l_3mg劑量，加入姜黃素底物；
[0020]步驟三，底物加入菌液中共培養(yǎng)4-8天后，減壓抽濾除去菌絲，濾液以等體積乙酸乙酯萃取3次，有機相合并，減壓濃縮至干；
[0021]步驟四，殘渣經(jīng)硅膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇100: 1,50:1和10: l，v/v的梯度洗脫，得到產(chǎn)物。
[0022]本發(fā)明的R.chinensis IFFI 3043對姜黃素的轉(zhuǎn)化能力很強，減壓抽濾很好地除去了菌絲，梯度洗脫使產(chǎn)物得到較好的分離和收集，培養(yǎng)8h后約有57%姜黃素底物轉(zhuǎn)化成姜黃素V -Ο-β-D-葡萄糖苷；PDA培養(yǎng)基能夠為華根霉R.chinensis的生長過程提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)，使微生物能夠快速穩(wěn)定的生長，生長狀態(tài)良好，易于產(chǎn)物提取，生物轉(zhuǎn)化率高。此外，本發(fā)明的方法簡單，操作方便，較好的解決了姜黃素水溶性差導(dǎo)致的生物利用度低問題。
【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明實施例提供的微生物轉(zhuǎn)化制備姜黃素糖苷化產(chǎn)物的方法流程圖；
[0024]圖2是本發(fā)明實施例提供的生物轉(zhuǎn)化樣本的HPLC圖譜示意圖；
[0025]圖3是本發(fā)明實施例提供的Rhizopus chinensis IFFI 3043轉(zhuǎn)化姜黃素動力學(xué)示意圖；
[0026]圖4是本發(fā)明實施例提供的糖苷化產(chǎn)物的抗腫瘤活性評價。
【具體實施方式】
[0027]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0028]下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步描述。
[0029]本發(fā)明實施例中所使用的微生物為華根霉Rhizopus chinensis IFFI 3043，購自中國食品發(fā)酵工業(yè)研宄院。
[0030]如圖1所示，本發(fā)明實施例的微生物轉(zhuǎn)化法制備姜黃素糖苷化產(chǎn)物的方法，包括以下步驟:
[0031]SlOl:華根霉R.chinensis接種于液體PDA培養(yǎng)基，搖床上避光培養(yǎng)24h ；
[0032]S102:當(dāng)菌絲生長旺盛時，加入姜黃素底物繼續(xù)培養(yǎng)；
[0033]S103:減壓抽濾除去菌絲，濾液以等體積乙酸乙酯萃取，有機相合并，減壓濃縮至干;
[0034]S104:殘渣經(jīng)硅膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇梯度洗脫，得到姜黃素糖苷化產(chǎn)物。
[0035]本發(fā)明的具體實施例:
[0036]實施例中的PDA培養(yǎng)基:取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，置燒杯中加水1.0L煮沸30min，濾除馬鈴薯塊，將葡萄糖20g加入濾液中，攪拌至完全溶解，再補足濾液至1L，自然pH即可，固體斜面培養(yǎng)基另加2.5%瓊脂。
[0037]實施例1
[0038]一種微生物轉(zhuǎn)化法制備姜黃素糖苷化產(chǎn)物的方法，包括以下步驟:
[0039]步驟一，將菌株在無菌條件下接入培養(yǎng)基中(250mL三角瓶，裝80mL液體培養(yǎng)基)，25°C下于180rpm搖床上避光培養(yǎng)；
[0040]步驟二，當(dāng)菌絲生長旺盛時，按照每瓶2mg劑量，加入姜黃素底物；
[0041]步驟三，底物加入菌液中共培養(yǎng)6天后，減壓抽濾除去菌絲，濾液以等體積乙酸乙酯萃取3次。有機相合并，減壓濃縮至干；
[0042]步驟四，殘渣經(jīng)硅膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇(100: 1,50:1和10: 1,ν/ν)梯度洗脫，得到產(chǎn)物；
[0043]步驟五，對姜黃素轉(zhuǎn)化動態(tài)進行考察。分別測定底物姜黃素和姜黃素糖苷化產(chǎn)物培養(yǎng)液中的濃度隨培養(yǎng)時間變化的動態(tài)關(guān)系；
[0044]步驟六，對產(chǎn)物進行LC/MS分析。
[0045]實施例2
[0046]步驟一，將華根霉R.chinensis接種于250mL三角瓶中，每瓶盛80mL液體培養(yǎng)基，25°C下于180rpm搖床上避光培養(yǎng)24h，吸取其中5mL菌液置于100mL三角瓶中，每瓶盛380mL液體培養(yǎng)基，25°C下于180rpm搖床上避光培養(yǎng)；
[0047]步驟二，當(dāng)菌絲生長旺盛時，按照每瓶1mg劑量，加