一種適用于無血清培養(yǎng)系統(tǒng)的vero細(xì)胞馴化方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及獸用生物制品領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種適用于無血清培養(yǎng)系統(tǒng)的 vero細(xì)胞馴化方法及其在豬流行性腹瀉病毒增殖培養(yǎng)方法中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，國內(nèi)在動物疫苗的生產(chǎn)過程中，傳代細(xì)胞及病毒的增殖培養(yǎng)大多含有牛血 清。因為牛血清是天然培養(yǎng)基，所以其來源有限，價格連年上漲，增加了疫苗生產(chǎn)的原材料 成本；牛血清組分不明確、不穩(wěn)定，批次間的差異影響了疫苗產(chǎn)品的穩(wěn)定性；另外，血清供 應(yīng)鏈存在一定風(fēng)險，有潛在的外源病原污染風(fēng)險。而無血清（VP-SFM)培養(yǎng)系統(tǒng)無動物源成 分、無蛋白及蛋白水解物、無生長因子并且化學(xué)成分明確、原料安全、供應(yīng)鏈廣。用無血清培 養(yǎng)動物細(xì)胞進(jìn)行病毒繁殖、疫苗生產(chǎn)是目前生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)新技術(shù)的發(fā)展方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種適用于無血 清培養(yǎng)系統(tǒng)的vero細(xì)胞馴化方法及其在豬流行性腹瀉病毒增殖培養(yǎng)方法中的應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種適用于無血清培養(yǎng)系統(tǒng)的 vero細(xì)胞馴化方法，將凍存的vero細(xì)胞復(fù)蘇后置于血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并采用逐步降低血 清含量的方法馴化vero細(xì)胞。
[0005] 本發(fā)明所述的適用于無血清培養(yǎng)系統(tǒng)的vero細(xì)胞馴化方法，其中，包括以下步 驟：
[0006] (1)將凍存的vero細(xì)胞復(fù)蘇；
[0007] (2)將復(fù)蘇后的vero細(xì)胞置于血清培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，待vero細(xì)胞長滿單層時， 加入消化液I，以消化前vero細(xì)胞的體積與經(jīng)消化后的vero細(xì)胞的體積比為1:3進(jìn)行消 化傳代培養(yǎng)；
[0008] (3)將步驟（2)得到的vero細(xì)胞置于混合培養(yǎng)液I中進(jìn)行培養(yǎng)，待vero細(xì)胞長 滿單層時，加入消化液I，以消化前vero細(xì)胞的體積與經(jīng)消化后的vero細(xì)胞的體積比為 1:(2-3)進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)；
[0009] (4)將步驟（3)得到的vero細(xì)胞置于混合培養(yǎng)液II中進(jìn)行培養(yǎng)，待vero細(xì)胞長 滿單層時，加入消化液I，以消化前vero細(xì)胞的體積與經(jīng)消化后的vero細(xì)胞的體積比為 1:(2-3)進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)；
[0010] (5)將步驟（4)得到的vero細(xì)胞置于混合培養(yǎng)液III中進(jìn)行培養(yǎng)，待vero細(xì)胞長 滿單層時，加入消化液II，以消化前vero細(xì)胞的體積與經(jīng)消化后的vero細(xì)胞的體積比為 1:(2-3)進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)；
[0011] (6)將步驟（5)得到的vero細(xì)胞置于無血清培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，待vero細(xì)胞長 滿單層時，加入消化液II，以消化前vero細(xì)胞的體積與經(jīng)消化后的vero細(xì)胞的體積比為 I: (2-3)進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)，即得適用于無血清培養(yǎng)系統(tǒng)的ver〇細(xì)胞。
[0012] 本發(fā)明所述的適用于無血清培養(yǎng)系統(tǒng)的vero細(xì)胞馴化方法，其中，所述血清培養(yǎng) 液為含體積百分?jǐn)?shù)為8%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；所述無血清培養(yǎng)液為含4mM的L-谷 氨酰胺的VP-SFM培養(yǎng)液；所述混合培養(yǎng)液I是由體積百分?jǐn)?shù)為80%的血清培養(yǎng)液和體積 百分?jǐn)?shù)為20 %的無血清培養(yǎng)液組成的混合培養(yǎng)液；所述混合培養(yǎng)液II是由體積百分?jǐn)?shù)為 50%的血清培養(yǎng)液和體積百分?jǐn)?shù)為50%的無血清培養(yǎng)液組成的混合培養(yǎng)液；所述混合培 養(yǎng)液III是由體積百分?jǐn)?shù)為20 %的血清培養(yǎng)液和體積百分?jǐn)?shù)為80 %的無血清培養(yǎng)液組成的 混合培養(yǎng)液。在細(xì)胞馴化過程中，配制混合培養(yǎng)液時，應(yīng)先分別將血清營養(yǎng)液及無血清營養(yǎng) 液配制好后，再按照不同比例混合。
[0013] 本發(fā)明所述的適用于無血清培養(yǎng)系統(tǒng)的vero細(xì)胞馴化方法，其中，所述胎牛血清 購自gibco公司，批號為1128144 ;所述DMEM培養(yǎng)液購自Hyclone公司，批號為NZHl 194 ;所 述VP-SFM培養(yǎng)液購自gibco公司，批號為1637720 ;所述L-谷氨酰胺購自Sigma公司，批 號為 WXBB6280v。
[0014] 本發(fā)明所述的適用于無血清培養(yǎng)系統(tǒng)的vero細(xì)胞馴化方法，其中，所述消化液 I為由質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為〇. 25 %的胰酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 02 %的EDTA的Hanl s液組成的 EDTA-胰酶消化液；所述消化液II為TrypLE select，購自gibco公司，批號為1596842。
[0015] 本發(fā)明還提供一種豬流行性腹瀉病毒在無血清培養(yǎng)系統(tǒng)中的增殖培養(yǎng)方法，包括 如下步驟：
[0016] (1)將經(jīng)權(quán)利要求1所述的馴化方法培養(yǎng)得到的vero細(xì)胞置于VP-SFM培養(yǎng)液中 培養(yǎng)，待適應(yīng)VP-SFM培養(yǎng)液的vero細(xì)胞長成單層細(xì)胞后，傾去VP-SFM培養(yǎng)液上清，以體積 分?jǐn)?shù)為1-3%的劑量接入豬流行性腹瀉病毒，吸附1小時后，加入維持液；然后置于37°C體 積百分?jǐn)?shù)為5%的CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察單層細(xì)胞的病變情況；當(dāng)70%以上單層細(xì)胞 出現(xiàn)病變時，將單層細(xì)胞凍融2-3次，收獲病毒液，標(biāo)記為病毒液Fl代；
[0017] (2)將步驟⑴中的病毒液Fl代再以體積分?jǐn)?shù)為1-3 %的劑量接入適應(yīng)VP-SFM 培養(yǎng)液的長成單層的vero細(xì)胞中，吸附1小時后，加入維持液，置于37°C體積百分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)70%以上單層細(xì)胞出現(xiàn)病變時，將單層細(xì)胞凍融2-3次，收獲病毒 液，標(biāo)記為病毒液F2代；
[0018] (3)將步驟⑵中的病毒液F2代以體積分?jǐn)?shù)為1-3 %的劑量接入適應(yīng)VP-SFM的 長成單層的vero細(xì)胞中，吸附1小時后，加入維持液，置于37°C體積百分?jǐn)?shù)為5%的0) 2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)70 %以上單層細(xì)胞出現(xiàn)病變時，將單層細(xì)胞凍融2-3次，收獲病毒液，標(biāo)記 為病毒液F3代。
[0019] 本發(fā)明所述的豬流行性腹瀉病毒在無血清培養(yǎng)系統(tǒng)中的增殖培養(yǎng)方法，其中，所 述維持液由體積百分?jǐn)?shù)為0-80 %的DMEM培養(yǎng)液和體積分?jǐn)?shù)為20-100 %的含4mM的L-谷 氨酰胺的VP-SFM培養(yǎng)液組成的混合培養(yǎng)液。
[0020] 本發(fā)明所述的豬流行性腹瀉病毒在無血清培養(yǎng)系統(tǒng)中的增殖培養(yǎng)方法，其中，所 述DMEM培養(yǎng)液購自Hyclone公司，批號為NZHl 194 ;所述VP-SFM培養(yǎng)液購自gibco公司， 批號為1637720 ;所述L-谷氨酰胺購自Sigma公司，批號為WXBB6280V。
[0021] 實施本發(fā)明的一種適用于無血清培養(yǎng)系統(tǒng)的vero細(xì)胞馴化方法及其在豬流行性 腹瀉病毒增殖培養(yǎng)方法中的應(yīng)用，具有以下有益效果：
[0022] (1)采用逐漸減少血清含量的無血清培養(yǎng)方法對vero細(xì)胞進(jìn)行馴化培養(yǎng)，以使 vero細(xì)胞能適應(yīng)無血清培養(yǎng)的環(huán)境，得到一種能適應(yīng)無血清培養(yǎng)的vero細(xì)胞；馴化后的 vero能在VP-SFM中連續(xù)傳代培養(yǎng)至少50代。
[0023] (2)將豬流行性腹瀉病毒（PEDV毒）接種在經(jīng)上述方法馴化后的適應(yīng)VP-SFM的 vero中進(jìn)行傳代增殖培養(yǎng)，摸索其在不含血清條件下的培養(yǎng)增殖條件。結(jié)果顯示，在經(jīng)馴化 后的vero中，當(dāng)病毒維持液為由體積分?jǐn)?shù)為80 %的DMEM培養(yǎng)液及體積分?jǐn)?shù)為20 %的無血 清培養(yǎng)液組成的混合營養(yǎng)液時，PEDV毒能在該無血清條件下連續(xù)傳代培養(yǎng)3代，均能產(chǎn)生 明顯細(xì)胞病變，病毒含量可達(dá)l〇 7 33TCID5(l/ml，與有血清培養(yǎng)的PEDV毒的毒價相當(dāng)。所述無 血清培養(yǎng)液為含4mM的L-谷氨酰胺的VP-SFM培養(yǎng)液。
【附圖說明】
[0024] 下面將結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：
[0025] 圖1是經(jīng)馴化后的vero細(xì)胞在無血清培養(yǎng)液，即含4mM的L-谷氨酰胺的VP-SFM 中傳代增殖培養(yǎng)50代時的細(xì)胞形態(tài)圖；
[0026] 圖2是正常的未經(jīng)馴化的vero細(xì)胞在含8%胎牛血清的DMEM液中傳代增殖培養(yǎng) 50代時的細(xì)胞形態(tài)；
[0027] 圖3是在經(jīng)馴化后的vero細(xì)胞中培養(yǎng)的PEDV毒產(chǎn)生的細(xì)胞病變圖（維持液為含 體積百分?jǐn)?shù)為80%的DMEM的無血清培養(yǎng)液）；
[0028] 圖4是在經(jīng)馴化后的vero細(xì)胞中培養(yǎng)的PEDV毒產(chǎn)生的細(xì)胞病變圖（維持液為含 體積百分?jǐn)?shù)為50 %的DMEM的無血清培養(yǎng)液）；
[0029] 圖5是在未經(jīng)馴化的vero細(xì)胞中培養(yǎng)的PEDV毒產(chǎn)生的細(xì)胞病變圖（維持液為含 體積百分?jǐn)?shù)為2%的胎牛血清的DMEM液）；
[0030] 圖6是未接PEDV毒的經(jīng)馴化的vero細(xì)胞形態(tài)對照圖。
【具體實施方式】
[0031] 下面，結(jié)合附圖以及【具體實施方式】，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0032] 實施例1
[0033] -種適用于無血清培養(yǎng)系統(tǒng)的vero細(xì)胞馴化方