一種元基因組來源的β-甘露聚糖酶、其編碼基因及其表達(dá)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種真菌來源β -甘露聚糖酶、 其編碼基因及其高效異源表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002] β -甘露聚糖酶（mannan endo-β _1，4-mannosidase ;EC3. 2. 1. 78)是一類降解甘 露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的主鏈β -1，4-D-甘露吡喃糖 苷鍵的酶，它屬于一種半纖維素酶，有著廣泛的用途。國內(nèi)外現(xiàn)主要用于造紙工業(yè)紙漿的漂 白、油井的破膠、降解植物膠生產(chǎn)低聚糖用做雙歧桿菌促生長因子，防病抗衰老的保健食品 以及飼料工業(yè)中作為抗?fàn)I養(yǎng)因子。
[0003] β -甘露聚糖酶簡介。β -甘露聚糖酶是一種半纖維素水解酶，以內(nèi)切的方式降 解β-1，4_糖苷鍵，降解產(chǎn)物的非還原末端為甘露糖。在半纖維素中，甘露聚糖的含量僅次 于木聚糖，而且在許多植物中如淀粉一樣大量積累，例如，甘露聚糖在椰子、棕櫚、瓜兒豆、 洋槐、赤槐、魔芋等植物中大量儲存。β -甘露聚糖酶主要來源于細(xì)菌、放線菌、真菌等微生 物。大多數(shù)動物（哺乳類、鳥類、魚類等）則不能合成這種酶，一旦動物消化道的微生物不 能分泌足量的甘露聚糖酶來降解食物中的甘露聚糖，甘露聚糖容易和大量的水結(jié)合，使食 糜的黏稠度增加，從而容易降低消化道對營養(yǎng)成份的吸收。而甘露聚糖酶降解甘露聚糖所 產(chǎn)生的甘露低聚糖是一種生物化學(xué)益生素，可以改善腸道微生物組成，形成以雙歧桿菌和 乳酸菌為優(yōu)勢的腸道菌群。這是由于甘露低聚糖可以作為營養(yǎng)物質(zhì)被雙歧桿菌和乳酸菌選 擇性發(fā)酵利用，并促進(jìn)其生長繁殖，而大腸桿菌、沙門氏菌等致病菌則無法利用而導(dǎo)致饑餓 死亡。此外，甘露低聚糖還可以結(jié)合病原菌細(xì)胞壁上的受體，從而阻止病原菌和腸道黏膜上 的糖基結(jié)合，保護(hù)消化道黏膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整，甘露低聚糖還能與毒素相結(jié)合，緩解這 些抗原的吸收，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫。甘露低聚糖為非消化性物質(zhì)，這種復(fù)合物 能順利通過消化道而排出體外，因此具有保健作用。甘露低聚糖不僅直接參與免疫調(diào)節(jié)，還 可以部分代替抗生素，起到降低機(jī)體組織抗生素殘留的作用。
[0004] β-甘露聚糖酶的應(yīng)用。β-甘露聚糖酶和甘露低聚糖可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、 飼料、紡織、石油等工業(yè)領(lǐng)域，如甘露低聚糖是最有效的雙岐因子之一，可以口服，國內(nèi)外已 經(jīng)廣泛地用于保健品中。β-甘露聚糖酶還可用于從豆類植物中提植物油，降低咖啡、巧克 力、可可液的粘性。甘聚糖酶和木聚糖酶協(xié)同作用可用于造紙工業(yè)。甘露聚糖酶還 可作為石油壓裂液的破膠劑具有效力高、成本低、對地層傷害小等優(yōu)點(diǎn)。特別是利該酶來 水解魔芋以制備高純度的甘露糖，其市前景十分廣闊。作為生產(chǎn)原料的魔芋廣泛的分于四 川、云南、貴州、湖北西部等欠發(fā)達(dá)的山區(qū)，酶的大規(guī)模生產(chǎn)對于科技扶貧也有著重要的推 作用。而最關(guān)鍵是甘露聚糖酶添加在飼料中，除了增加動物營養(yǎng)的吸收率和抵抗力之外，它 還可以促進(jìn)類胰島素生長因子IGF-I的分泌，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，提高瘦肉率，已經(jīng)超越了 傳統(tǒng)酶制劑的作用，成為一種新型的促生長飼料添加劑。因而，近年來對甘露聚糖酶的研究 逐漸成了國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。但是國內(nèi)各有關(guān)科研單位的研究大多限于實(shí)驗(yàn)室階段，所報 道的發(fā)酵酶活酶解產(chǎn)物組成不穩(wěn)定，生產(chǎn)成本較高，難以取得競爭優(yōu)勢。篩選高比活酶基 因，應(yīng)用基因工程技術(shù)建高效產(chǎn)酶的微生物，進(jìn)行分子育種改良酶的性狀，優(yōu)化甘露低聚糖 的酶解制備工藝，是國際上的研究熱點(diǎn)和方向，也具有很好的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。
[0005] 甘露聚糖酶的生產(chǎn)。甘露聚糖酶生產(chǎn)方法的研究涉及酶的重組表達(dá)、特性 研究、基因克隆與生產(chǎn)純化等方面。1958年，人們第一次報道了能夠生產(chǎn)β-甘露聚糖酶 的真菌。之后大量β_甘露聚糖酶的生產(chǎn)菌株被篩選、誘變。在我國，中國科學(xué)院馬延和等 利用嗜堿芽孢桿菌Ν16-5以魔芋粉為原料，發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶，發(fā)酵液酶活力達(dá)到 15(^/1111，甘露低聚糖的提取收率在8〇%以上（微生物學(xué)報，1991，31(6) :443~448)。0-甘 露聚糖酶雖然廣泛存在于微生物體內(nèi)，但是越來越多研究發(fā)現(xiàn)，原核微生物來源的β -甘 露聚糖酶酶活性質(zhì)比真核微生物來源的要優(yōu)良。微生物產(chǎn)生β_甘露聚糖酶的基質(zhì)雖然不 相同，但絕大部分微生物的β_甘露聚糖酶都是胞外誘導(dǎo)酶，需要在培養(yǎng)基中添加 β_甘露 聚糖（魔芋粉或赤槐豆膠等）。隨著基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，β_甘露聚糖 酶的研究工作越來越集中在基因克隆、重組表達(dá)和酶的活性工程等研究上來。
[0006] 因此，本領(lǐng)域有待于利用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，進(jìn)一步鑒定新的、效果優(yōu)良 的β-甘露聚糖酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種β -甘露聚糖酶（ManI)和它的編碼基因（manl)在大 腸桿菌和里氏木霉中的高效表達(dá)和應(yīng)用；本發(fā)明還涉及該酶的突變體；本發(fā)明還涉及含有 所述編碼基因及其編碼基因的表達(dá)載體、啟動子序列、輔助序列和宿主細(xì)胞；本發(fā)明還涉及 表達(dá)編碼基因的重組菌及其突變體，本發(fā)明還涉及利用所述β_甘露聚糖酶降解葡萄甘露 聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖、甘露聚糖產(chǎn)生甘露低聚糖和甘露糖的方法。
[0008] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多肽，該多肽選自下組：
[0009] (a)如 SEQ ID NO:3 所示的多肽；
[0010] (b)具有SEQ ID NO:2中第14-317位所示的氨基酸序列的多肽；
[0011] (c)將（a)或（b)多肽的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個（如1-20個，較佳地1-10個； 更佳地1-5個；更佳地1-3個）氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a)多肽 功能的由（a)衍生的多肽；
[0012] ⑷具有（a)或（b)多肽功能的SEQ ID NO:3的蛋白片段（較佳地，其與SEQ ID NO:2的序列相同性高于70% ;更佳地高于75% ;更佳地高于80% ;更佳地高于85% ;更佳地高 于90% ;更佳地高于95% ;更佳地高于98%或99%);
[0013] (e)在（a)或（b)多肽的N或C末端具有標(biāo)簽序列，或在其N末端具有信號肽序列 的多肽。
[0014] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸 序列選自下組：（1)編碼所述多肽的多核苷酸；（2)與多核苷酸（1)互補(bǔ)的多核苷酸。
[0015] 在一個優(yōu)選例中，該多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2所示。
[0016] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種載體，其特征在于，它含有所述的多核苷酸。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體是真核表達(dá)載體。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體是里氏木霉表達(dá)載體，例如pHDt/sk。
[0019] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，它含有所述的載體，或其 基因組中整合有所述的多核苷酸。
[0020] 在一個優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞；較佳地是絲狀真菌細(xì) 胞（如里氏木霉等）。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為非生殖細(xì)胞。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為里氏木霉。
[0024] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種所述的多肽的制備方法，該方法包含：（i)培養(yǎng)所 述的宿主細(xì)胞；（ii)收集含有所述的多肽的培養(yǎng)物；和（iii)從培養(yǎng)物中分離出所述的多 肽。
[0025] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多肽或所述的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物的用途，用于 水解糖苷鍵；較佳地為3-l，4-D-糖苷鍵；或用于形成甘露低聚糖。
[0026] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種組合物，它含有所述的多肽或含有所述宿主細(xì)胞 的培養(yǎng)物以及醫(yī)學(xué)、食品學(xué)、飼料學(xué)或工業(yè)上可接受的載體