一種新型細(xì)胞色素cyp3a4酶特異性探針反應(yīng)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種木脂素類化合物戈米辛A，其可作為細(xì)胞色 素CYP3A4酶的特異性探針底物，用于定量檢測不同來源生物樣本及體內(nèi)細(xì)胞色素CYP3A4 酶活性。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞色素P450酶（CytochromeP450,CYP)為一類亞鐵血紅素一硫醇鹽蛋白的超 家族，是人體內(nèi)最重要的I相藥物代謝酶，催化多種內(nèi)源和外源物質(zhì)的代謝。該超家族包 含多個亞家族，如CYP1A2,CYP2D6,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19,CYP2E1,CYP3A4 和CYP3A5 等， 參與約80%以上的上市藥物的代謝轉(zhuǎn)化，其中經(jīng)CYP3A亞家族代謝的藥物約占50%(Nat RevDrugDiscov. 2005, 4 (10) : 825-833)。人體中主要表達(dá)四種CYP3A亞型，分別為CYP3A4、 CYP3A5、CYP3A7及CYP3A43。其中CYP3A4在成人體內(nèi)總細(xì)胞色素CYP酶中含量最高，在體 內(nèi)各組織器官廣泛的分布，相比于人群中表達(dá)量低、表達(dá)頻率低的CYP3A5, 一直被認(rèn)為是成 年個體的最主要的CYP單酶。由于CYP3A5亞家族與CYP3A4具有83%的高度同源性[Curr DrugMetab. 2008,9:20 - 33]，CYP3A4和CYP3A5兩個亞家族通常具有相似的底物識別性， 即某一底物若被CYP3A4催化代謝，也極可能同時被CYP3A5亞型酶代謝。但已有研究發(fā)現(xiàn) CYP3A代謝的底物在這兩種單酶的催化性質(zhì)不盡相同。在人類肝臟中，CYP3A被認(rèn)為是最 主要的CYP3亞型，且在女性中有更高的表達(dá)量。CYP3A5存在基因多態(tài)性，其在肝臟中表達(dá) 量的個體差異可從〇%到50% ;CYP3A5的表達(dá)還存在種族差異，僅三分之一的高加索人（白種 人）和一半以上的非洲裔美國人表達(dá)CYP3A5。由此可見，由于遺傳因素和非遺傳因素的影 響，CYP3A4和CYP3A5亞型酶，無論是其表達(dá)量、催化功能，還是代謝貢獻(xiàn)率都會存在很大的 個體差異性，這對于CYP3A介導(dǎo)代謝的藥物在體內(nèi)的暴露水平會產(chǎn)生不可忽視的影響。
[0003] 目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的或已在體外、體內(nèi)研究中廣泛應(yīng)用的CYP3A亞家族探針底物，如 咪達(dá)唑侖（midazolam)、硝苯地平（nifedipine)、睪酮（testosterone)等，都同時是CYP3A4 和CYP3A5的特異性底物，利用這些探針底物對細(xì)胞色素CYP酶進(jìn)行的評估結(jié)果反映的就是 細(xì)胞色素CYP3A亞家族各單酶的催化能力的總和。然而，近期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素CYP3A5 在某些個體中顯現(xiàn)的催化能力甚至與細(xì)胞色素CYP3A4的催化能力相當(dāng)（DrugMetab Dispos. 2002, 30:883-891)，此時利用目前已有的探針底物則會混淆細(xì)胞色素CYP3A4和 3A5的催化能力，從而無法清晰地分析細(xì)胞色素CYP3A4對特定藥物的代謝清除貢獻(xiàn)率。
[0004] 此外，在大鼠（細(xì)胞色素CYP3A1、細(xì)胞色素CYP3A2)、狗(細(xì)胞色素CYP3A12、細(xì)胞 色素CYP3A26)，兔（細(xì)胞色素CYP3A6)，豬（細(xì)胞色素CYP3A29)，猴（細(xì)胞色素CYP3A64)等 哺乳動物體內(nèi)，也高表達(dá)細(xì)胞色素CYP3A4的同功酶，這些酶之間的底物有非常廣泛的重疊 性。利用細(xì)胞色素CYP3A4的高選擇性探針底物也可在體外活性測定方面實現(xiàn)對不同種屬 中細(xì)胞色素CYP3A4的同功酶的評價與考察。
[0005] 目前，CYP3A4酶活性的體外評價體系主要包括重組單酶、哺乳動物的亞細(xì)胞組分 、新鮮分離的肝細(xì)胞、肝切片、肝灌流等（ToxicologyinVitro2006, 135-153)，其中已經(jīng) 商品化的重組細(xì)胞色素CYP3A4單酶主要來自于細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞以及酵母菌 建立的克隆表達(dá)體系，而亞細(xì)胞組分主要包括微粒體、細(xì)胞漿及S9成分。采用這些標(biāo)準(zhǔn)化 的評價體系，結(jié)合相應(yīng)的輔因子(如：NADPH等）和孵育條件，可通過檢測探針底物的代謝清 除或產(chǎn)物生成速率，對上述各種體系中表達(dá)的CYP3A4酶活性進(jìn)行表征。
[0006] 此外，采用靜脈注射或口服的方式，使待測人或動物服用一定劑量的探針底物，在 一定時間內(nèi)，搜集血漿和尿液樣本，測定其中原型化合物或其代謝產(chǎn)物的含量，以此來作為 整體水平細(xì)胞色素CYP3A活性的評價指標(biāo)。Lin(Pharmacogenetics2001, 11 (9) :781-791) 等人使用咪達(dá)唑侖作為體內(nèi)探針，給健康成年人靜脈注射或口服一定劑量之后，發(fā)現(xiàn)服藥4 小時后的血漿中咪達(dá)唑侖濃度與血藥濃度曲線下面積（AUC)存在較好的相關(guān)性，可以用來 對機(jī)體對細(xì)胞色素CYP3A介導(dǎo)藥物代謝的清除能力進(jìn)行判斷。Furuta(US6905839B2)等人 采用內(nèi)源性皮質(zhì)醇作為細(xì)胞色素CYP3A的內(nèi)源性體內(nèi)探針，通過測定志愿者血漿樣品中皮 質(zhì)醇的濃度和尿液樣品中代謝產(chǎn)物6P-羥基皮質(zhì)醇的濃度，采用尿中6P-羥基皮質(zhì)醇的 累積量與血漿皮質(zhì)醇AUC的比值反映體內(nèi)CYP3A活性大小，發(fā)現(xiàn)該指標(biāo)可以很好的表征體 內(nèi)細(xì)胞色素CYP3A的活性，進(jìn)而用于不同人體的CYP3A活性標(biāo)定，對于作為CYP3A底物的已 上市藥物，可作為指導(dǎo)該類藥物的個體給藥劑量調(diào)整的重要依據(jù)。
[0007] 綜上所述，特異性地評估體內(nèi)外細(xì)胞色素CYP3A4代謝酶活性及CYP3A4對特定藥 物代謝清除的貢獻(xiàn)率的關(guān)鍵在于選擇高特異性的探針?biāo)幬铩?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一類木脂素類化合物以及其在檢測CYP3A4酶活性中的用 途及其檢測方法，具體為戈米辛A可作為CYP3A4酶的高特異性探針底物，用于定量測定不 同來源生物樣本及體內(nèi)CYP3A4的酶活。與目前已報道的CYP3A探針/標(biāo)準(zhǔn)底物不同，戈米 辛A具有高特異性表征CYP3A4酶活性的能力，CYP3A5催化活性極微弱可忽略不計。因此 能夠高特異性的評價機(jī)體或組織中CYP3A4酶對藥物的代謝處置能力，對體內(nèi)外藥物代謝 研究具有重要意義。
[0009] 本發(fā)明具體提供了一種新型細(xì)胞色素CYP3A4酶特異性探針底物，其特征在于：該 探針底物為戈米辛A(GomisinA)，是一種天然木脂素類成分，該化合物的結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0010] 本發(fā)明還提供了所述新型細(xì)胞色素CYP3A4酶特異性探針底物的應(yīng)用，其特征在 于：采用所述新型細(xì)胞色素CYP3A4酶特異性探針底物檢測CYPP3A4酶活性：通過定量定時 測定相應(yīng)代謝產(chǎn)物的生成速率或底物的減少速率實現(xiàn)CYP3A4酶活性的檢測。
[0011] 戈米辛A僅能被CYP3A4選擇性代謝并生成一個主要代謝產(chǎn)物8-羥基戈米辛A，其 余代謝酶包括CYP3A5均難以催化其代謝，8-羥基化反應(yīng)符合米氏動力學(xué)，其單位時間內(nèi)的 轉(zhuǎn)化速率可用于定量測定不同生物體系(包括重組單酶體系、人及動物細(xì)胞/組織制備液 等）中細(xì)胞色素CYP3A4酶的活性。
[0012] 采用重組細(xì)胞色素CYP單酶，肝微粒體孵育體系進(jìn)行考察，通過相關(guān)性分析，特異 性抑制實驗，重組單酶代謝反應(yīng)，以及酶反應(yīng)動力學(xué)幾方面的證據(jù)，證明戈米辛A可特異性 的經(jīng)CYP3A4酶代謝(如圖2所示)，生成8-羥基戈米辛A，高效液相圖譜見圖3,原形及代謝 產(chǎn)物的質(zhì)譜圖見圖4,代謝通路與代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)見圖5。進(jìn)一步采用各種哺乳動物的新鮮提 取的肝微粒體、原代培養(yǎng)肝細(xì)胞、肝切片、肝灌流等代謝評價體系進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)該代謝 反應(yīng)具有非常良好的特異性。
[0013] 作為高特異性的細(xì)胞色素CYP3A4的探針底物，戈米辛A可以用來檢測細(xì)胞色素 CYP3A4酶活性，尤其適合用于對細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞以及酵母菌克隆表達(dá)體系生 產(chǎn)的CYP3A4重組酶、多種哺乳動物組織器官來源的微粒體、S-9等制備物中CYP3A4的活性 標(biāo)定，以及體內(nèi)CYP3A4活性的標(biāo)定。
[0014] 本發(fā)明還提供了戈米辛A與已有CYP3A4探針底物睪酮、硝苯地平、咪達(dá)唑侖在代 謝酶選擇性上的優(yōu)勢比較：戈米辛A作為特異性探針底物，在CYP3A4和CYP3A5兩種重組 單酶孵育體系中，通過相應(yīng)代謝產(chǎn)物的酶反應(yīng)動力學(xué)分析(如圖6所示)，證明戈米辛A在 CYP3A4與CYP3A5中的最大反應(yīng)速度（Vm)之比顯著高于睪酮、硝苯地平和咪達(dá)唑侖(如圖7 所示)，表明CYP3A4對戈米辛A的催化效能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CYP3A5的催化效能，即高選擇性的被 CYP3A4代謝，而CYP3A5的催化貢獻(xiàn)極微弱可忽略不計。
[0015] 本發(fā)明所述新型細(xì)胞色素CYP3A4酶特異性探針底物的應(yīng)用，其特征在于，采用所 述新型細(xì)胞色素CYP3A4酶特異性探針底物在體外檢測生物樣本中細(xì)胞色素CYP3A4酶活 性，其優(yōu)選的測定方法及條件為：
[0016] --體系中以戈米辛A中作為探針底物；底物濃度范圍為1-500iiM;
[0017] -在pH7. 4且具有輔因子NADPH或其生成體系的孵育體系中，反應(yīng)溫度為 10-60°C之間，優(yōu)選37°C為最優(yōu)反應(yīng)時間；
[0018]--反應(yīng)時間為5-60min;確保獲得相應(yīng)羥化代謝產(chǎn)物達(dá)到定量限且底物轉(zhuǎn)化率 低于20%時終止反應(yīng)；
[0019] -通過檢測單位時間內(nèi)底物減少量或產(chǎn)物生成量，即底物減少速率或產(chǎn)物生成 速率，作為CYP3A4酶活性的評價指標(biāo)，實現(xiàn)細(xì)胞色素CYP3A4酶活性的檢測。
[0020] 其中檢測底物減少量或其對應(yīng)羥化產(chǎn)物生成量的定量檢測方法為紫外吸收光譜、 質(zhì)譜、放射性同位素示蹤技術(shù)、熒光激發(fā)光譜、蒸發(fā)光散射或電化學(xué)光譜檢測。所有檢測器 包括紫外吸收光譜檢測器、質(zhì)譜、放射性同位素示蹤技術(shù)、蒸發(fā)光散射或電化學(xué)光譜檢測器 中的一種或多種串聯(lián)。
[0021] 本發(fā)明所述新型細(xì)胞色素CYP3A4酶特異性探針底物還可以檢測體內(nèi)細(xì)胞色素 CYP3A4酶活性，其優(yōu)選的測定方法及條件為：
[0022] --通過靜脈注射或口服的方式，使得待測的哺乳動物服用0. 1至500mg/kg體重 的戈米辛A或其藥物制劑；
[0023]--在〇至24小時內(nèi)選取時間點(diǎn)，收集待測動物的血漿樣本；
[0024] -測定底物減少速率或產(chǎn)物生成速率，作為細(xì)胞色素CYP3A4酶活的評價指標(biāo)。
[0025] 本發(fā)明還提供了含有所述新型細(xì)胞色素CYP3A4酶特異性探針底物的藥物制劑， 其特征在于：所述藥物制劑含有戈米辛A。
[0026] 本發(fā)明還提供了含有所述新型細(xì)胞色素CYP3A4酶特異性探針底物的藥物組合 物，其特征在于：所述藥物組合物由戈米辛A與任何可藥用載體/成分所組成。
[0027] 選用本發(fā)明所述CYP3A4酶的特異性探針底物檢測CYP3A4酶活性具有以下突出優(yōu) 勢：
[0028] (1)高特異性：戈米辛A可被目標(biāo)CYP3A4高特異性地代謝成為相應(yīng)的羥化產(chǎn)物。
[0029] (2)高安全性：戈米辛A的毒性極低，大鼠口服半數(shù)致死量（LD5tl)為980mg/kg，在 使用劑量下底物及其代謝產(chǎn)物均安全無毒，適合開發(fā)成為體內(nèi)探針?biāo)幬铩?br>[0030] (3)易于制備：底物戈米辛A是五味子科植物莖葉及果實中富含的一種天然化學(xué) 成分，來源簡單且易于分離純化。
[0031] (4)檢測靈敏：該化合物為具有聯(lián)苯環(huán)辛烯母核結(jié)構(gòu)的化合物，有良好的紫外吸 收特性（230~280nm)及質(zhì)譜離子化效果，可通過常規(guī)分析手段（如LC-UV、LC-ESI-MS等） 對其定量分析。