用于捕獲空氣中真菌孢子的微流控芯片及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可以捕獲富集空氣中真菌孢子的微流控芯片，并提供了該芯片的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]空氣微生物具有傳播快和范圍廣的特點，一旦爆發(fā)疫情，會迅速擴散而造成極大的社會恐慌，因此開發(fā)針對空氣微生物的快速檢測分析技術(shù)至關(guān)重要?？諝庵械恼婢咦拥某叽缂s10-50 μπι，可以粘附在大氣氣溶膠顆粒上并隨風擴散傳播，容易導致人呼吸道傳染疾病和手術(shù)后醫(yī)院院內(nèi)感染(HAI)，對公民健康造成嚴重威脅。此外，空氣真菌孢子隨風飄落在農(nóng)業(yè)作物上，容易引發(fā)大范圍的真菌感染疫情，造成糧食減產(chǎn)，從而威脅食品安全。
[0003]當前，依據(jù)我國針對空氣微生物的檢測方法和衛(wèi)生標準(GB/T18204.3-2013)，針對空氣中的真菌的分析方法主要是重力沉降法(如平皿落板)和撞擊采樣法(如孢子采集器、安德森采樣器)，其原理均是先將空氣中的真菌或孢子收集到培養(yǎng)基上，然后在28V經(jīng)過約5天的培養(yǎng)繁殖，再進行顯微鏡鏡檢等分析研宄。但是，此類方法中抽氣獲得的微生物快速撞擊在培養(yǎng)基上，極易造成菌株的死亡。而氣流速度相對較慢的靜電場采樣技術(shù)則難以有效捕獲帶電荷較少的氣溶膠顆粒。這種技術(shù)方法存在的嚴重缺陷還有:(I)自然界絕大多數(shù)真菌尚無法培養(yǎng)，可培養(yǎng)的真菌種類只占總數(shù)的不到1%，因此基于培養(yǎng)法的分析技術(shù)，其檢測對象極為有限。(2)從樣本采集到得出分析結(jié)果，往往需要一周的時間，無法滿足實時快速的需要。目前真正能夠?qū)崿F(xiàn)空氣真菌快速監(jiān)測的平臺有美國Lawrence Livermore國家實驗室開發(fā)的APDS系統(tǒng)(Autonomous Pathogen Detect1n System)，系結(jié)合了氣溶膠飛行時間質(zhì)譜(AT0FMS)，可以同時監(jiān)測數(shù)十種微生物目標。類似的技術(shù)還有Pratt等建立的基于離子阱質(zhì)譜(ITMS)的生物氣溶膠監(jiān)測系統(tǒng)。繼911和炭疽菌事件以后，美國已經(jīng)投資650多億美元建立了 3000多個基于上述技術(shù)的生物氣溶膠監(jiān)測站，在全國范圍內(nèi)監(jiān)測可能出現(xiàn)的各種空氣疾病疫情，但這些系統(tǒng)的價格極其昂貴，設(shè)備龐大且操作復(fù)雜，不利于快速布置和大范圍應(yīng)用。鏡檢、質(zhì)譜、核酸和蛋白分析等方法，則對操作人員的專業(yè)技能和經(jīng)驗要求較高。傳統(tǒng)的免疫學檢測方法依賴于特異性抗體的開發(fā)，常見微生物的抗體容易獲得，但目前環(huán)境中大多數(shù)微生物尚無商業(yè)化抗體，因此是無法檢測到的。在我國，為了有效地對公共場所和中央空調(diào)出風口的病原細菌和真菌進行實時監(jiān)測，有關(guān)部門對我國空氣生物安全檢測技術(shù)提出了新的要求:(I)分析速度快，有助于早期預(yù)警和快速反應(yīng)；(2)檢測通量高，可同時監(jiān)測多種疾病疫情；(3)便攜性好、成本低廉，利于全國范圍內(nèi)的推廣普及。但是，現(xiàn)有的技術(shù)均無法滿足上述三點需求，因此，對空氣傳播疾病的監(jiān)測和預(yù)防仍是一個世界性難題，也是我國空氣生物安全面臨的重要挑戰(zhàn)。
[0004]針對空氣真菌疾病的檢測分析技術(shù)，未來的發(fā)展主要集中在檢測儀器的微型化、高通量和低成本上，即:⑴便攜性強，以滿足現(xiàn)場快速布置的需要；⑵檢測通量高，以滿足針對多種微生物并行分析的需要；(3)制造簡單且成本低，以滿足大范圍普及應(yīng)用的需要。儀器設(shè)備的微型化集中體現(xiàn)在微流控芯片技術(shù)平臺，以微流控芯片為基礎(chǔ)的微型生物分析儀和傳感器是未來生物學快速檢測技術(shù)的一大發(fā)展趨勢。
[0005]微流控技術(shù)是近年發(fā)展起來的新型交叉學科技術(shù)，在微生物檢測分析領(lǐng)域已顯現(xiàn)出諸多優(yōu)勢。與常規(guī)方法相比，微流控芯片平臺可以進行微升、納升甚至皮升級的生物化學反應(yīng)，極大降低了試劑的消耗量(至少2-3個數(shù)量級)。芯片微通道中的傳質(zhì)和傳熱速率更高，使反應(yīng)和分析時間都大幅縮短[19]。構(gòu)建微流控芯片的聚二甲基硅氧烷材料(PDMS)具有良好的物理、化學特性和生物相容性，可以滿足絕大部分的生物醫(yī)學研宄應(yīng)用。同時，多種功能性模塊(如微閥門、微泵和光電元件等)都可以集成在芯片中，通過計算機進行精確控制。這種集成化數(shù)控式微流控芯片可以方便地對溫度、壓力等生化反應(yīng)條件進行更精確的自動化操控，滿足不同檢測和分析的需要，能夠完成很多常規(guī)技術(shù)難以實現(xiàn)的復(fù)雜分析。此外，由于芯片的尺寸都很小，往往只有數(shù)平方厘米，重量僅數(shù)十克，因此便于攜帶，特別適合于現(xiàn)場快檢的應(yīng)用。芯片分析產(chǎn)生的廢液極少(微升級)，對檢測廢物的封裝和處理也都非常方便。目前，基于微流控技術(shù)的多種新型檢測分析系統(tǒng)已經(jīng)相繼問世，如自動化PCR分析、腫瘤早期診斷、蛋白結(jié)晶分析和單細胞精確定量分析等設(shè)備。近年來隨著加工制造工藝的不斷提高，還可以在芯片內(nèi)構(gòu)建數(shù)十納米的超微結(jié)構(gòu)，從而實現(xiàn)對單分子DNA和病毒等納米尺度的生命物質(zhì)進行精確操控?？梢?，以微流控芯片為基礎(chǔ)開發(fā)的新型生物檢測分析設(shè)備特別適合于現(xiàn)場快速檢測分析和現(xiàn)場得出結(jié)果(POCT)的應(yīng)用。
[0006]總之，現(xiàn)有的針對空氣真菌孢子的檢測技術(shù)方法，均存在需耗時數(shù)天培養(yǎng)和依賴大型設(shè)備難以攜帶的嚴重缺陷，不利于現(xiàn)場快速檢測。本發(fā)明的基于微流控技術(shù)的空氣真菌孢子捕獲富集芯片能夠很好的解決上述問題，具有速度快和微型化的優(yōu)勢，可以滿足現(xiàn)場快速檢測的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種具有高效、便攜、低價和制造簡單的用于對空氣中的真菌孢子進行快速捕獲富集的微流控芯片，并提供該芯片的制備方法。。該雙層微流控芯片以光學透明材料為基材，由氣體流動管道和孢子截留陣列管道對合組成，由往復(fù)泵作為芯片的抽氣動力源。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0009]一種用于捕獲空氣中真菌孢子的雙層微流控芯片，包括雙層芯片結(jié)構(gòu)、往復(fù)泵、芯片抽氣孔和空氣樣本進氣孔；氣體流動層的多條氣體流動管道的寬度為700 μm，深度為40 μπι，為光滑平直的凹槽；對應(yīng)的截留層的多條孢子截留管道含有魚骨狀結(jié)構(gòu)陣列，每一個截留單元的寬度為70 μ m，深度為70 μ m，截留單元間距為100 μ m ;氣體流動管道與孢子截留管道通過對接鍵合，組成雙層芯片結(jié)構(gòu)。氣體流動層的多條管道一端分別含有位于微流控芯片外圍的空氣樣本進氣孔，另一端匯聚于微流控芯片中央位置的芯片抽氣孔，并與往復(fù)泵相連接。
[0010]利用連接在芯片中央抽氣孔的往復(fù)泵進行抽氣，將空氣樣品通過位于芯片邊緣的多個進氣孔分別進入芯片內(nèi)的氣體流動和孢子截留管道中，并形成振蕩氣流，空氣中的真菌孢子被沉積和截留吸附于管道內(nèi)壁。然后用微升級的培養(yǎng)基或裂解緩沖液將捕獲到的真菌孢子從芯片管道中洗脫；洗脫得到的樣品溶液經(jīng)過處理后直接連接PCR擴增微流控芯片，從而完成現(xiàn)場快速檢測分析。
[0011]本發(fā)明的氣體流動管道和孢子截留管道的個數(shù)可由實際情況確定，選擇18條為宜，也可以根據(jù)實際需求增加或減少管道數(shù)量。氣體流動管道或孢子截留管道之間也可以進行串聯(lián)或并聯(lián)。
[0012]本發(fā)明中微流控芯片的基材為光學透性良好且具有彈性的聚二甲基硅氧烷聚合物(PDMS) ο
[0013]本發(fā)明提供上述雙層微流控芯片的制備方法，步驟如下:
[0014](I)基片制備:利用Prianha溶液對單晶硅片進行清洗，用氮氣吹干后采用SU-82050系列負光刻膠經(jīng)旋涂機甩涂后，在恒溫加熱板上軟烘焙，使光刻膠固化；
[0015](2)曝光:將設(shè)計好的含有氣體流動管道和孢子截留管道的掩膜板分別置于硅片表面，利用紫外曝光機在負光刻膠上進行曝光；
[0016](3)顯影:將娃片置于顯影液中顯影，再用異丙醇清洗干凈，用氮氣吹干；
[0017](4)烘焙:將硅片置于在加熱板上，緩慢加熱以固定陽模；
[0018](5)澆注:將聚