一種利用細(xì)菌纖維素膜固定化丙酮丁醇梭菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于固定化細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種以改性后細(xì)菌纖維素膜為載 體固定化梭菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 梭菌屬微生物中，丙酮丁醇梭菌常用于發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，但傳統(tǒng)的游離發(fā)酵，生產(chǎn)周 期長，效率低，不能長期連續(xù)發(fā)酵，產(chǎn)物與菌體難以分離。固定化細(xì)胞可以克服以上問題，實(shí) 現(xiàn)連續(xù)批次發(fā)酵，提高生產(chǎn)效率，降低成本。
[0003] 細(xì)菌纖維素具有獨(dú)特的超細(xì)網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，該材料具有高比表面積，含有大量孔 隙結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞吸附和固定。然而細(xì)菌纖維素結(jié)構(gòu)單一，高親水性，不利于菌體的吸附， 熱穩(wěn)定性以及機(jī)械穩(wěn)定性能差影響其作為固定化材料的穩(wěn)定性。由于細(xì)菌纖維素全部由葡 萄糖苷鍵和氫鍵連接而成，化學(xué)結(jié)構(gòu)分子式中含有大量的羥基基團(tuán)，易于改性和表面修飾， 將其與其它原子團(tuán)或分子組合制成更高性能的物質(zhì)，在固定化材料方面，將具有良好的發(fā) 展?jié)摿蛻?yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種對細(xì)菌纖維素膜進(jìn)行改性的方法，將該方 法得到的細(xì)菌纖維素膜作為梭菌的固定化載體，固定化后的梭菌發(fā)酵性能提高，能夠連續(xù) 批次發(fā)酵。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] -種利用細(xì)菌纖維素膜固定化丙酮丁醇梭菌的方法，該方法包括如下步驟：
[0007] (1)細(xì)菌纖維素膜的疏水改性：用酸處理細(xì)菌纖維素干膜，清洗，干燥，得到細(xì)菌 纖維素膜A ;再用堿處理細(xì)菌纖維素膜A，清洗，干燥，得到細(xì)菌纖維素膜B ;對細(xì)菌纖維素膜 B表面進(jìn)行乙?；揎?、酯化修飾、硅烷偶聯(lián)劑修飾、高分子聚合物修飾或有機(jī)膦偶聯(lián)劑修 飾，制備得到改性的細(xì)菌纖維素膜；優(yōu)選利用乙?；揎?、硅烷偶聯(lián)劑修飾或硅烷偶聯(lián)劑修 飾；最優(yōu)選硅烷偶聯(lián)劑修飾。
[0008] (2)改性的細(xì)菌纖維素膜固定化梭菌：將步驟（1)得到的改性的細(xì)菌纖維素膜固 定在連續(xù)發(fā)酵罐內(nèi)，通入丙酮丁醇梭菌菌懸液，自循環(huán)培養(yǎng)，得到固定化了丙酮丁醇梭菌的 細(xì)菌纖維素膜。
[0009] 只要是能產(chǎn)丁醇的丙酮丁醇梭菌都能作為本發(fā)明中改性細(xì)菌纖維素膜的固定化 對象，優(yōu)選的丙酮丁醇梭菌為 Clostridium acetobutylicum B3(CGMCC No. 5234)。
[0010] 所述的自循環(huán)培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件為：35~40°C，30~40rpm/min，由下自上循環(huán)，優(yōu) 選：37°C，30rpm/min〇 toon] 步驟（1)中，所述的細(xì)菌纖維素干膜，通過發(fā)酵制備得到，所述的發(fā)酵包括如下步 驟：
[0012] (Ia)將木醋桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在30°C條件下培養(yǎng)24h，得到一級種 子；
[0013] (2a)將步驟（la)得到的一級種子轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)18~ 24h，優(yōu)選培養(yǎng)18h，轉(zhuǎn)速為150rpm，得到二級種子液；
[0014] (3a)將步驟（2)得到的二級種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C條件下靜置培養(yǎng) 72h，形成細(xì)菌纖維素膜，收集發(fā)酵液中的細(xì)菌纖維素膜，用水沖洗，將其在堿液中浸泡，再 次沖洗使其PH為中性，然后干燥處理，制備得到細(xì)菌纖維素干膜，所述的干燥處理是冷凍 干燥，冷凍干燥的條件為：-20°C，24h〇
[0015] 只要能產(chǎn)細(xì)菌纖維素的木醋桿菌都能用上述方法產(chǎn)細(xì)菌纖維素，優(yōu)選的木醋桿菌 為 ATCC 23769
[0016] 步驟（Ia)中，所述的斜面培養(yǎng)基，其配方為：葡萄糖80~120g/L，酵母粉8~12g/ L，碳酸鈣15~25g/L，瓊脂15~20g/L，pH = 6. 4~7. 0,溶劑為水；斜面培養(yǎng)基的配方優(yōu) 選為：葡萄糖l〇〇g/L，酵母粉10g/L，碳酸鈣20g/L，瓊脂15g/L，pH = 6. 8,溶劑為水；
[0017] 步驟（2a)中，所述的種子培養(yǎng)基，其配方為：葡萄糖18~20g/L，蛋白胨8~IOg/ L，酵母粉4~6g/L，磷酸氫二鈉2. 5~3g/L，梓檬酸1~L 5g/L，硫酸鎂0· 2~0· 3g/L，pH =6. 0~6. 5,溶劑為水；種子培養(yǎng)基的配方優(yōu)選為：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉 5g/L，磷酸氫二鈉2. 7g/L，檸檬酸I. 2g/L，硫酸鎂0· 25g/L，ρΗ6· 0,溶劑為水；
[0018] 步驟（3a)中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其配方為：葡萄糖18~20g/L，蛋白胨8~IOg/ L，酵母粉4~6g/L，磷酸氫二鈉2. 5~3g/L，梓檬酸1~L 5g/L，硫酸鎂0· 2~0· 3g/L，pH =6. 0~6. 5,溶劑為水；發(fā)酵培養(yǎng)基的配方優(yōu)選為：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉 5g/L，磷酸氫二鈉2. 7g/L，檸檬酸I. 2g/L，硫酸鎂0· 25g/L，ρΗ6· 0,溶劑為水；
[0019] 步驟（3a)中，所述的在堿液中浸泡，是將細(xì)菌纖維素膜置于0. 1~0. 2mol/L的 NaOH水溶液中，NaOH的濃度優(yōu)選為0. lmol/L，在60~80°C條件下浸泡1~2h，浸泡溫度 優(yōu)選為80°C，浸泡時間優(yōu)選為lh。
[0020] 步驟（1)中，所述的用酸處理細(xì)菌纖維素干膜，將細(xì)菌纖維素干膜在0. 5~lmol/ L的HCl中浸泡1~2h ;HC1的濃度優(yōu)選為lmol/L，浸泡時間優(yōu)選為lh。
[0021] 步驟（1)中，所述的用堿處理細(xì)菌纖維素膜A，將細(xì)菌纖維素膜A在20~50g/L的 NaOH中浸泡2~8h ;Na0H的濃度優(yōu)選為20g/L，浸泡時間優(yōu)選為8h。
[0022] 步驟⑴中，所述的乙?；揎棧ㄈ缦虏襟E：將細(xì)菌纖維素膜B浸入乙?；?劑中，細(xì)菌纖維素膜B與乙?；噭┑谋壤秊镮g :5ml~25ml，加入催化劑，在60~100°C 條件下，反應(yīng)0. 5~3h，反應(yīng)溫度優(yōu)選為70°C，反應(yīng)時間優(yōu)選為2h，反應(yīng)結(jié)束用水沖洗，干 燥，制備得到改性的細(xì)菌纖維素膜；
[0023] 所述的乙酰化試劑為已酸酐、氯乙酰或冰醋酸，乙酰化試劑優(yōu)選為已酸酐；
[0024] 所述的催化劑為硫酸或碘，其中硫酸的加入量為10~12mol/L，碘的加入量為 0. 05~0. 15mmol/L，所述的催化劑優(yōu)選為硫酸。
[0025] 步驟⑴中，所述的酯化修飾，包括如下步驟：將細(xì)菌纖維素膜B按5g/L~10g/L 加入吡啶或三乙胺中，再加入酯化劑，細(xì)菌纖維素與酯化劑的比例為0. 5~2g : 100ml，50~ 150°C條件下，優(yōu)選反應(yīng)溫度為50°C，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)1~3h，反應(yīng)時間優(yōu)選為2h，用乙醇清 洗，再用水沖洗，干燥，制備得到改性的細(xì)菌纖維素膜；
[0026] 所述的酯化劑是硫酸、醋酸、己酸或十二酸，所述的酯化劑優(yōu)選為十二酸。
[0027] 步驟（1)中，所述的硅烷偶聯(lián)劑修飾，包括如下步驟：將硅烷偶聯(lián)劑與甲苯按體積 比為I : 1~2的比例混合，將細(xì)菌纖維素按5~20g/L加入硅烷偶聯(lián)劑中，再加入與硅烷偶 聯(lián)劑等摩爾量的異咪唑，室溫下反應(yīng)1~3h，反應(yīng)時間優(yōu)選為2h，用水清洗，干燥，制備得到 改性的細(xì)菌纖維素膜；
[0028] 所述的硅烷試劑是烷基二甲基氯硅烷、丁基二甲基氯硅烷、辛基二甲基氯硅烷或 十二烷基二甲基氯硅烷，所述的硅烷試劑優(yōu)選為丁基二甲基氯硅烷。
[0029] 步驟（1)中，所述的高分子聚合物修飾，包括如下步驟：將細(xì)菌纖維素膜B按照 5~20g/L加入高分子聚合物中，得到混合物，將該混合物與甲苯按照體積比為1:1~2的 比例混合，以Sn (Oct) 2為催化劑，80~95°C，優(yōu)選80°C，反應(yīng)12~24h，優(yōu)選24h，用水清洗， 干燥，制備得到改性的細(xì)菌纖維素膜；
[0030] 所述的高分子聚合物為聚乳酸或聚己內(nèi)酯，所述的高分子聚合物優(yōu)選為聚乳酸。
[0031] 步驟（1)中，所述的有機(jī)膦偶聯(lián)劑修飾，包括如下步驟：將膦酸或亞磷酸衍生物溶 于有機(jī)溶劑制成飽和溶液，按照流速為1~2ml/min逐滴加入到細(xì)菌纖維素薄膜中，60~ l〇〇°C，有限60°C，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)2~6h，優(yōu)選反應(yīng)2h，乙醇清洗，再用水清洗，干燥，制 備得到改性的細(xì)菌纖維素膜；
[0032] 所述的亞磷酸衍生物為苯基膦或苯基次膦酸，所述的亞磷酸衍生物優(yōu)選為苯基 膦；所述的有機(jī)溶劑為二氯甲烷或四氫呋喃，所述的有機(jī)溶劑優(yōu)選為二氯甲烷。
[0033] 上述細(xì)菌纖維素膜固定化梭菌的方法制備得到的固定化了