一種超聲強(qiáng)化微藻培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微藻培養(yǎng)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可用于生產(chǎn)生物能源、生物材料、食品、飼料、保健品和藥品的超聲強(qiáng)化微藻培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微藻作為寶貴的生物資源，至今還沒有得到充分利用的一個重要原因就是沒有經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)系統(tǒng)。目前，用于微藻培養(yǎng)的方法有跑道式培養(yǎng)法、光生物反應(yīng)器培養(yǎng)法等，然而，跑道式培養(yǎng)法所需的跑道式培養(yǎng)池僅能培養(yǎng)少數(shù)幾個在選擇性培養(yǎng)基中生長的藻種，例如螺旋藻和鹽藻等微藻品種；而光生物反應(yīng)器培養(yǎng)法中用到的封閉的光生物反應(yīng)器系統(tǒng)能培養(yǎng)大多微藻品種，但是建造成本和運(yùn)行成本很高。這種情況很大程度上限制了微藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0003]跑道式養(yǎng)殖池最初設(shè)計于上世紀(jì)六十年代，目前技術(shù)比較成熟，被廣泛地用于螺旋藻、小球藻、杜氏鹽藻和雨生紅球藻的養(yǎng)殖，然而，由于跑道式培養(yǎng)池是一個開放的培養(yǎng)設(shè)施，其中培養(yǎng)的微藻很容易受到外來物種的污染；同時，培養(yǎng)池的溫度等培養(yǎng)條件很難控制，不能為微藻提供理想的培養(yǎng)條件。光生物反應(yīng)器可以提供封閉的培養(yǎng)環(huán)境和可以調(diào)控的培養(yǎng)條件，理論上可以比較好地培養(yǎng)絕大多數(shù)的微藻品種，是多年來業(yè)界研發(fā)的重點，但是目前光生物反應(yīng)器還存在建造和使用成本高的問題，僅適用于高附加值微藻產(chǎn)品的生產(chǎn)，在微藻產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用有一定的局限性。
[0004]目前的光生物反應(yīng)器的設(shè)計和建造是微藻生物技術(shù)領(lǐng)域的難點之一。雖然經(jīng)過多年研宄發(fā)展，各種類型的反應(yīng)器被設(shè)計和建造，甚至被用于商業(yè)化生產(chǎn)微藻產(chǎn)品，但是一直沒有大規(guī)模的成熟穩(wěn)定的造價低廉的光生物反應(yīng)器設(shè)施出售。沒有合適的光生物反應(yīng)器系統(tǒng)已經(jīng)成了微藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。光生物反應(yīng)器可以提供封閉的培養(yǎng)環(huán)境和可以調(diào)控的培養(yǎng)條件，理論上可以比較好地培養(yǎng)絕大多數(shù)的微藻品種，是多年來業(yè)界研發(fā)的重點，但是目前光生物反應(yīng)器還存在建造和使用成本高的問題，僅適用于高附加值微藻產(chǎn)品的生產(chǎn)，在微藻產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用有一定的局限性，對于批量微藻培養(yǎng)的方法還沒有形成一整套成熟的工藝路線。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為此，本發(fā)明提出了一種超聲強(qiáng)化微藻培養(yǎng)的方法，該方法采用光生物反應(yīng)器和跑道式培養(yǎng)池聯(lián)合進(jìn)行微藻培養(yǎng)的技術(shù)，能有效降低微藻培養(yǎng)成本，并形成了一整套完整的培養(yǎng)微藻的工藝路線。
[0006]一種超聲強(qiáng)化微藻培養(yǎng)的方法，包括以下步驟:
[0007]a、挑選及清洗一定量的藻類，制作微藻固體培養(yǎng)基，將微藻的實驗室保種擴(kuò)種培養(yǎng)，首先選取適宜微藻生長需要的液體培養(yǎng)基，向其中加入I %的瓊脂糖凝膠，即得固體培養(yǎng)基，將固體培養(yǎng)基置入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20°C，光照強(qiáng)度30uE/m2/s ；
[0008]b、選取經(jīng)過純化無菌的微藻藻種，將其接種到所述固體培養(yǎng)基中，封口培養(yǎng)；最后依次進(jìn)行微藻藻種的初始擴(kuò)大培養(yǎng)、中繼培養(yǎng)，在中繼培養(yǎng)之后對微藻藻種進(jìn)行質(zhì)量控制，篩選出優(yōu)質(zhì)微藻藻種；
[0009]C、將步驟b所得優(yōu)質(zhì)微藻藻種放入室外光生物反應(yīng)器內(nèi)，開通反應(yīng)器控制單元，設(shè)置溫度控制在25°C，pH 7.4，通氣量25L/min ;反應(yīng)完成后再進(jìn)行超聲處理，超聲的功率為500?3000W/m2，并進(jìn)行超聲處理，得微藻種植液；
[0010]d、將步驟c所得微藻種植液接種到室外跑道式培養(yǎng)池，在跑道式培養(yǎng)池內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模微藻培養(yǎng)，直至藻液變?yōu)樯罴t色時，收集整池藻液，在所述室外跑道式培養(yǎng)池中的PH為8.0，培養(yǎng)時間為8天；
[0011]e、接d，對整池藻液進(jìn)行下游處理，進(jìn)行分離，采收藻細(xì)胞。
[0012]優(yōu)選的，將優(yōu)質(zhì)微藻藻種放入室外氣升管道式光生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，控制溫度為 12-28°C, pH 7.0-8.0，通氣量在 100L/min，培養(yǎng) 5-7 天。
[0013]本發(fā)明所帶來的有益技術(shù)效果:
[0014]本發(fā)明通過對優(yōu)質(zhì)微藻藻種進(jìn)行超聲處理，超聲波導(dǎo)致的細(xì)胞壁局部破裂能夠提高細(xì)胞膜的通透性，從而促進(jìn)代謝產(chǎn)物的釋放等作用，以促進(jìn)細(xì)胞的生長及代謝，提高生長速度，促進(jìn)代謝產(chǎn)物積累，縮短培養(yǎng)周期。
[0015]本發(fā)明培養(yǎng)過程中進(jìn)行超聲處理不會降低微藻細(xì)胞中的油脂或烴的含量，從而不會對能源微藻的經(jīng)濟(jì)價值產(chǎn)生影響；
[0016]將室外光生物反應(yīng)器和跑道式培養(yǎng)池結(jié)合，該方法能夠大規(guī)模培養(yǎng)微藻，相比單純的跑道式反應(yīng)池和單純的光生反應(yīng)器培養(yǎng)微藻，本發(fā)明顯著降低了生產(chǎn)成本，并開發(fā)了一整套完整的工藝路線。
【具體實施方式】
[0017]本發(fā)明所選原料均可通過商業(yè)渠道得到。
[0018]本發(fā)明，一種超聲強(qiáng)化微藻培養(yǎng)的方法，具體包括以下步驟:
[0019]第一步、微藻的實驗室擴(kuò)大培養(yǎng)
[0020]1、配制微藻保種固體培養(yǎng)基
[0021]根據(jù)微藻的生長需要，選用適宜的液體培養(yǎng)基，加入瓊脂糖凝膠，高溫滅菌后在無菌工作臺上利用無菌培養(yǎng)皿制作無菌固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基溫度下降至常溫凝固后用封口膜密封后在溫度為4°C保存。
[0022]2、微藻藻種的保存
[0023]將經(jīng)過純化無菌的微藻藻種在無菌操作臺內(nèi)接種到上述步驟I制作的固體培養(yǎng)基上保種培養(yǎng)，培養(yǎng)可以在裝有照明光源的培養(yǎng)箱內(nèi)，需要保種培養(yǎng)的時候，將載有微藻藻種的培養(yǎng)皿移到無菌操作臺，用無菌簽轉(zhuǎn)移微藻到空白的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿，然后用封口膜封口后再放到培養(yǎng)箱培養(yǎng)，保種培養(yǎng)的時間間隔可以根據(jù)微藻生長速度來確定。
[0024]3、藻種的初始擴(kuò)大培養(yǎng)
[0025]配置液體培養(yǎng)基，分別分裝到大、中、小三類三角培養(yǎng)瓶內(nèi)，分裝的液體體積大約為10-20mL、100-300mL和500-1000mL，用鋁箔和棉塞將三角瓶封口后高溫滅菌待用；初始擴(kuò)種第一步在無菌操作臺內(nèi)用無菌棉簽將微藻從固體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移少許到小三角培養(yǎng)瓶，在有光源的搖床培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；經(jīng)過幾天到幾個星期的培養(yǎng)，培養(yǎng)液顏色變深后，再經(jīng)無菌操作轉(zhuǎn)移到中培養(yǎng)瓶和大培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。
[0026]4、藻種的中繼培養(yǎng)
[0027]配置液體培養(yǎng)基到容量為1L或20L的透明桶內(nèi)，高溫滅菌待用，將大培養(yǎng)瓶內(nèi)的藻液經(jīng)無菌操作轉(zhuǎn)移到滅菌后的培養(yǎng)桶內(nèi)培養(yǎng)，向桶內(nèi)通入無菌的混有二氧化碳的空氣，提供適量的光照，控制培養(yǎng)室內(nèi)的溫度，對于易于沉降的藻類，輔助以搖床設(shè)施防止藻類沉降。
[0028]5、藻種擴(kuò)大過程的質(zhì)量控制
[0029]在藻種液體擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，要十分注意控制微藻種液的質(zhì)量?？梢酝ㄟ^外觀和顯微鏡觀察鑒定藻種的質(zhì)量，外觀觀察是看藻液的顏色是否正常、是否存在沉淀和附壁的現(xiàn)象；對大多說經(jīng)濟(jì)微藻來說，沉淀和附壁是不正常的，說明藻種生長不良，應(yīng)該放棄藻種并高溫滅活，顯微觀察是觀察微藻的微觀形態(tài)是否正常，是否有外來的藻類或者微生物污染，一旦發(fā)現(xiàn)藻種污染，應(yīng)該立即放棄藻液并做高溫滅活處理。
[0030]第二步、微藻的光生物反應(yīng)器培養(yǎng)
[0031]1、光生物反應(yīng)器的準(zhǔn)備
[0032]光生物反應(yīng)器在接種之前，進(jìn)行清洗消毒；反應(yīng)器的液體接觸部分可以用化學(xué)試劑漂白液或高錳酸鉀溶液等進(jìn)行消毒，反應(yīng)器的氣體管路用臭氧或二氧化氮等氣體消毒劑消毒，消毒后，通入無菌水清洗；最后接通反應(yīng)器的監(jiān)測和控制設(shè)備，通入過濾除菌的空氣，加入過濾除菌的培養(yǎng)劑，校驗反應(yīng)器的監(jiān)測控制設(shè)備。
[0033]2、小規(guī)模光生物反應(yīng)器的接種
[0034]將數(shù)桶經(jīng)過質(zhì)量檢查的藻種無菌導(dǎo)入準(zhǔn)備好的光生物反應(yīng)器內(nèi)，觀察和記錄反應(yīng)器的監(jiān)測結(jié)果和控制設(shè)備的有效性，設(shè)置方應(yīng)器的控制參數(shù)。
[0035]3、光生物反應(yīng)器的微藻擴(kuò)大培養(yǎng)
[0036]接種后的小規(guī)模反應(yīng)器經(jīng)過幾天的培養(yǎng)后，達(dá)到適宜的培養(yǎng)濃度，就可以轉(zhuǎn)移藻液到大規(guī)模反應(yīng)器培養(yǎng)，藻液轉(zhuǎn)移前，要先準(zhǔn)備好大規(guī)模的反應(yīng)器，轉(zhuǎn)移過程采用無菌操作，保證藻液不受到外來的生物污染，轉(zhuǎn)移后的小規(guī)模反應(yīng)器清洗備用。
[0037]4、光生物反應(yīng)器的微藻半連續(xù)培養(yǎng)
[0038]大規(guī)模的反應(yīng)器經(jīng)過幾天的培養(yǎng)后，達(dá)到了微藻生產(chǎn)能力的最高水平，這時候進(jìn)行超聲培養(yǎng)，微藻在光生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)可以采用半連續(xù)的方式。
[0039]第三步、微藻的跑道式培養(yǎng)池培養(yǎng)
[0040]1、跑道式