選材以生產(chǎn)中廣泛種植的石斛品系，參見(jiàn)表1。本實(shí)施例以20份石斛的 葉片提取DNA，建立了這20份石斛品系的DNA指紋圖譜。這些石斛材料具有較好的代表性。 [0032] 表1 :石斛種質(zhì)及其來(lái)源

[0035] 2、石斛品系的DNA提取及純化
[0036] 取石斛幼苗兩三片，以Doyle等人提出的CTAB法提取 DNA(Focus, 1990, 12:13-15)，所得產(chǎn)物用 TE緩沖液（IOmM Tris-HCl，0.1 mM EDTA)保存。然 后用NanoUV-3000超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，稀釋至20ng · μΓ1，于-20°C下保存 備用。
[0037] 3、SRAP-PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)
[0038] 采用1(^1^反應(yīng)體系，其中包括]\%(：122.0臟〇14-1，(1階1 3各為0.2臟〇1*171，引物 0· 50 μL?ο? · Γ1，模板 DNA 50ng，Taq DNA 聚合酶 1U。
[0039] PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3min ;94°C變性lmin，35°C復(fù)性lmin，72°C延伸 lmin，5 個(gè)循環(huán)；94°C變性 lmin，55°C復(fù)性 lmin，72°C延伸 2min，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min。
[0040] 電泳步驟如下：擴(kuò)增產(chǎn)物加5 μ L上樣緩沖液，94°C變性5min。然后迅速將其置于 冰上冷卻。采用4%變性聚丙烯酰胺凝膠，0. 5XTBE緩沖液，50W恒功率電泳約I. 5h，銀染 檢測(cè)電泳結(jié)果。選擇有代表性的多態(tài)性SRAP擴(kuò)增條帶構(gòu)建供試材料的指紋圖譜。
[0041] 4、構(gòu)建DNA指紋圖譜
[0042] 構(gòu)建指紋圖譜時(shí)，本著用最少引物、最少條帶，又要把所有供試樣品區(qū)分開(kāi)來(lái)的原 貝丨J，本實(shí)施例從110對(duì)SRAP引物中篩選出MEl和EM7 ;ME1和EM14 ;ME3和EM3 ;ME3和EM5 ; ME8和EM14 ;ME9和EM3這6對(duì)專用引物組合。引物序列參見(jiàn)表2。
[0043] 表2 :石斛DNA指紋圖譜的引物序列
[0044]

[0045] 上述6對(duì)引物共擴(kuò)增出127個(gè)條帶，從中選取其中11條穩(wěn)定性和重復(fù)性良好、多 態(tài)性高的條帶，用于構(gòu)建這20個(gè)石斛材料的DNA指紋圖譜。參見(jiàn)圖1，該圖為引物組合ME8 和EM14引物對(duì)在20份石斛材料中的電泳圖。其中，a表示特征條帶為180bp ;b表示特征 條帶為190bp。c表示特征條帶為240bp;采用的引物對(duì)為ME8和EM14。電泳圖中M泳道代 表1OObp marker，泳道1-20的標(biāo)號(hào)分別對(duì)應(yīng)編號(hào)SH-I到SH-20的石斛材料。
[0046] 根據(jù)每條引物呈現(xiàn)的條帶信息建立指紋圖譜。根據(jù)這11條擴(kuò)增條帶的有無(wú)，繪制 出所有20個(gè)材料的DNA指紋圖譜。在該圖譜中，每個(gè)材料都具有其特異的DNA指紋。為了 描述方便，設(shè)定用" 1"表示圖譜中某個(gè)位置上有擴(kuò)增條帶存在，用"〇"表示在該位置上沒(méi)有 擴(kuò)增條帶存在。最終，每個(gè)材料都擁有了有" 1"和"〇"組成的一串短數(shù)字。
[0047] 如表3所示，本實(shí)施例中20份石斛材料的DNA指紋圖譜中，左欄為石斛品系，右欄 為相對(duì)應(yīng)的有11個(gè)數(shù)字串。
[0048] 表3 :20個(gè)石斛材料的DNA指紋

[0051] 上述表3中a表示ME8和EM14引物對(duì)，特征條帶為180bp。b表示ME8和EM14引 物對(duì)，特征條帶為190bp。c表示ME8和EM14引物對(duì)，特征條帶為240bp。d表示ME9和EM3 引物對(duì)，特征條帶為250bp。e表示ME9和EM3引物對(duì)，特征條帶為260bp。f表示MEl和 EM7引物對(duì)，特征條帶為220bp。g表示MEl和EM7引物對(duì)，特征條帶為140bp。h表示MEl 和EM14引物對(duì)，特征條帶為170bp。i表示MEl和EM14引物對(duì)，特征條帶為250bp。j表示 ME3和EM3引物對(duì)，特征條帶為150bp。k表示ME3和EM5引物對(duì)，特征條帶為150bp。
[0052] 實(shí)施例2
[0053] 本發(fā)明石斛DNA指紋圖譜用于石斛的種質(zhì)鑒定
[0054] 假設(shè)供試材料中SH是生產(chǎn)上應(yīng)用的優(yōu)良品種，現(xiàn)有一批石斛不能確定是否是真 正的石斛SH-15?？砂凑杖缦路椒▽?duì)它的DNA指紋進(jìn)行鑒定。
[0055] 石斛標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋圖譜建立以后，要對(duì)某個(gè)樣品進(jìn)行真?zhèn)涡澡b定時(shí)，提取待測(cè)樣 品DNA，用提取的DNA為模板，用MEl和EM7 ;ME1和EM14 ;ME3和EM3 ;ME3和EM5 ;ME8和 EM14 ;ME9和EM3這6對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在4 %變性聚丙烯酰胺凝膠 上電泳，銀染，繪制出該待測(cè)樣品的DNA指紋圖譜，與標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，就可以知 道該品種是否是真正的石斛SH-15。
[0056] 結(jié)果表明它的DNA指紋是00000101100,這與SH-15的標(biāo)準(zhǔn)指紋是一致的，因此所 檢測(cè)的石斛品種是SH-15。如果待測(cè)樣品的指紋不是00000101100,那么該材料就不是真正 的 SH-15。
[0057] 上述僅為本發(fā)明的部分優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明并不僅限于實(shí)施例的內(nèi)容。對(duì)于本領(lǐng) 域中的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在本發(fā)明技術(shù)方案的構(gòu)思范圍內(nèi)可以有各種變化和更改，所作的任 何變化和更改，均在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種獲取石斛DNA指紋圖譜的專用引物，其特征在于，所述專用引物選自以下引物 對(duì)中的一對(duì)或多對(duì)：SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 7;SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 8;SEQID NO. 2 和SEQIDNO. 5 ;SEQIDNO. 2 和SEQIDNO. 6 ;SEQIDNO. 3 和SEQIDNO. 8 ;SEQID NO. 4 和SEQIDNO. 5。2. 如權(quán)利要求1所述的一種獲取石斛DNA指紋圖譜的專用引物，其特征在于，所述專 用引物由序列表中的以下6對(duì)引物組成：SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 7;SEQIDNO. 1和SEQ IDNO. 8 ;SEQIDNO. 2 和SEQIDNO. 5 ;SEQIDNO. 2 和SEQIDNO. 6;SEQIDNO. 3 和SEQ IDNO. 8 ;SEQIDNO. 4 和SEQIDNO. 5。3. 如權(quán)利要求1或2所述的一種獲取石斛DNA指紋圖譜的專用引物，其特征在于，所述 專用引物獲取DNA指紋圖譜的石斛品種為霍山石斛和鐵皮石斛。4. 一種石斛DNA指紋圖譜的建立方法，該方法包括如下步驟： 步驟1，提取石斛材料的基因組DNA作為模板，用權(quán)利要求1-2中任一所述專用引物進(jìn) 行SRAP-PCR擴(kuò)增； 步驟2,將前述步驟中得到的SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，用銀 染顯示DNA條帶，獲得石斛DNA指紋圖譜。5. -種石斛DNA指紋圖譜，該指紋圖譜由權(quán)利要求4所述的方法建立獲得。6. 權(quán)利要求5所述的一種石斛DNA指紋圖譜，該指紋圖譜為：01100000000， 01000000000,00000110101，00000100101，00010111001，10010011000,00010110001， 00001101100,00000100001，00010101100,00010110000,00000101101，00001110100， 00000101100,00010110100,00000100000,00010100000,00010100010,00000001000 ;其中 數(shù)字"1"表示圖譜中確定位置上存在擴(kuò)增條帶，"0"表示圖譜中該位置上沒(méi)有擴(kuò)增條帶存 在。7. 權(quán)利要求1或2所述的任一專用引物在獲取石斛DNA指紋圖譜中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種石斛DNA指紋圖譜及其專用引物和建立方法。所述專用引物其核苷酸序列如序列表所示，所述專用引物選自以下引物對(duì)中的一對(duì)或多對(duì)：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。采用石斛材料的基因組DNA作為模板，用上述任一專用引物進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增；將得到的SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，用銀染顯示DNA條帶，獲得石斛DNA指紋圖譜。本發(fā)明創(chuàng)建了石斛DNA指紋圖譜，能從遺傳本質(zhì)上對(duì)石斛品系進(jìn)行種質(zhì)鑒定，準(zhǔn)確、可靠。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN104894288
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510381643
【發(fā)明人】李懷志, 劉士輝, 姚永康, 孫文華, 金靜, 郭飛, 孫洪助, 劉青海
【申請(qǐng)人】上海孫橋現(xiàn)代農(nóng)業(yè)聯(lián)合發(fā)展有限公司
【公開(kāi)日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年7月2日