模擬原核途徑的植物自固氮的制作方法
【專利說明】
[0001] 與相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年7月25日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/858, 218和2012年12 月3日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/732, 490的優(yōu)先權(quán)，所述每個(gè)臨時(shí)申請(qǐng)以其全部?jī)?nèi)容通過 參考并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開涉及一種新的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物通過靶向或表達(dá)細(xì)菌的 nif(固氮）基因以產(chǎn)生固氮酶的結(jié)構(gòu)蛋白，并通過導(dǎo)入編碼與固氮酶的結(jié)構(gòu)蛋白同源的蛋 白質(zhì)的合成DNA序列，來復(fù)制光合細(xì)菌例如藍(lán)細(xì)菌或其他細(xì)菌的固氮機(jī)制，還涉及產(chǎn)生這 樣的植物的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 植物是屬于植物界的活生物體。所有高等植物具有維管組織木質(zhì)部（主要運(yùn)輸水 和礦物質(zhì)）和韌皮部（主要運(yùn)輸糖類和其他代謝物）。維管植物包括所有具種子的植物（裸 子植物和被子植物）和蕨類植物（包括羊齒類植物、石松類植物和木賊類植物），其也被稱 為導(dǎo)管植物。它們是具有有組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的真核生物，所述細(xì)胞結(jié)構(gòu)包括核（在大多數(shù) 細(xì)胞中）和具有在光合作用期間使用光例如日光作為能源進(jìn)行碳固定的能力的葉綠體（或 其他類型的質(zhì)體）。其他類型的植物包括例如藻類、苔蘚和真菌。
[0005] 農(nóng)業(yè)作物的作物生產(chǎn)率的總體限制因素是土壤和水中的氮含量。隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)試 圖與增長(zhǎng)的人口的不斷增加的需求和減少的可用耕地保持同步，這種元素的供應(yīng)隨時(shí)間減 少。氮是所有生命形式、包括植物必需的重要營(yíng)養(yǎng)物之一。然而，氮必須首先被轉(zhuǎn)變成植物 可以利用的形式。生物固氮（BNF)現(xiàn)象是使用固氮酶將大氣中的氮（N2)轉(zhuǎn)變成氨（NH3)。 BNF通常由下列化學(xué)反應(yīng)式表示：N2+8H++8ell6ATP?>2NH3+H2+16ADP+16Pi，或者說在8個(gè) 質(zhì)子和8個(gè)電子存在下并消耗16個(gè)ATP分子（三磷酸腺苷一一細(xì)胞的能量分子），將氮?dú)?分子還原成兩個(gè)氨分子。由于隊(duì)含有叁鍵，這個(gè)反應(yīng)消耗大量能量。氮?dú)夥肿又械逆I能約 為225kcal/mol。在自然界中，很少有BNF作為構(gòu)成"固氮酶復(fù)合體"的植物與幾個(gè)細(xì)菌物 種之間的共生關(guān)系的結(jié)果而進(jìn)行。固氮酶復(fù)合體由兩種蛋白構(gòu)成：Fe蛋白（被稱為Nif-H 的酶）和Mo-Fe蛋白（被稱為Nif-D-K的a和0亞基）。固氮酶復(fù)合體由與同二聚體 (至少兩個(gè)相同單元）的Fe(鐵輔因子）蛋白暫時(shí)結(jié)合的異四聚體（不是相同單元）的 MoFe(鐵-鉬輔因子）蛋白構(gòu)成。
[0006]Nif-H基因編碼鐵蛋白，Nif-D和K基因編碼鉬鐵蛋白。因此，Nif-D和Nif-K基 因在它們的最終活性形式中需要Mo和Fe作為輔因子。Nif-D編碼Nif-D蛋白，也被稱為 a亞基，Nif-K編碼Nif-K的蛋白被稱為0亞基。換句話說，Nif-H是具有兩個(gè)相同亞基 的二聚體酶（總共2個(gè)蛋白），而Nif-D-K是2a20二聚體（總共4個(gè)蛋白）。所有6個(gè) 亞基對(duì)于其功能來說是必需和必要的。在自然界中，Nif-H具有大量變種，并對(duì)生物多樣性 有貢獻(xiàn)。存在大量類型的Nif-H這一事實(shí)，提供了適應(yīng)各種不同自然條件的能力。
[0007] 產(chǎn)生固氮酶復(fù)合體的細(xì)菌物種包括固氮生物例如藍(lán)細(xì)菌、固氮菌科 (azotobacteraceae)、根瘤菌（rhizobia)和弗蘭克氏菌（frankia)。例如，在藍(lán)細(xì)菌中， Mo-Fe蛋白（Nif-D-K)結(jié)合大氣中的氮（N2)，然后Fe-蛋白（Nif-H)通過由鐵氧化還原蛋白 貢獻(xiàn)的電子將它還原。鐵氧化還原蛋白是在光合作用電子傳遞鏈中起到電子載體作用的蛋 白質(zhì)，其類似于高等植物葉綠體的Fe2S2鐵氧化還原蛋白，但不完全一致。被還原的Fe-蛋 白使用ATP將（被還原的）電子傳遞到Mo-Fe蛋白，后者然后將電子貢獻(xiàn)給N2 (固氮酶還 原酶）。通過將這個(gè)過程重復(fù)幾次，將N^N的所有三個(gè)共價(jià)鍵還原成2NH3。
[0008] 然而，僅有幾種植物物種可以與固氮生物以共生關(guān)系生活。例如，來自于豆科植物 的豌豆植物與來自于根瘤菌科的細(xì)菌共生生活。具體來說，根瘤菌細(xì)菌穿透豌豆植物的根， 產(chǎn)生含有固定氮（成為氨）的細(xì)菌的根瘤，而植物貢獻(xiàn)碳（糖）。因此，改進(jìn)共生或擴(kuò)展宿 主范圍對(duì)于植物存活來說是有益的，但實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)包括許多挑戰(zhàn)，包括過程的復(fù)雜性和 基礎(chǔ)知識(shí)的欠缺。
[0009] 也可以使用人工方法將氮化學(xué)固定。這種固氮方法最通常通過被稱為Harber過 程的熱反應(yīng)來生產(chǎn)。這個(gè)過程對(duì)于相對(duì)簡(jiǎn)單的反應(yīng)來說需要高的壓力和溫度。最近一百年 來，對(duì)氮肥的需求穩(wěn)定地增長(zhǎng)到每年超過2億公噸。這種消耗量可能增加。
[0010] 非共生生物（例如與任何固氮微生物沒有確立的共生關(guān)系的自由生活的生物）， 如果各自包含核心酶固氮酶，可以實(shí)現(xiàn)自生物固氮（SBNF)。能夠自固氮的非細(xì)菌生物例如 作物和藻類以及其他植物的存在，對(duì)于幾種目的來說是有用的，例如降低施肥需求，降低施 肥污染，提供經(jīng)濟(jì)友好的作物生產(chǎn)，提高作物產(chǎn)量，提高植物中的油含量，提高植物中的蛋 白質(zhì)含量，降低水的氮污染，以及相對(duì)于氮提高碳含量和相對(duì)于土壤的有機(jī)相提高碳。然 而，出于幾個(gè)原因，沒有已知的能夠?qū)崿F(xiàn)這些結(jié)果的植物，其中一個(gè)原因是固氮酶的特殊酶 復(fù)合體，其包括幾種用于固氮的蛋白質(zhì)和基因。
[0011] 用于大氣氮固定的幾乎所有的核心酶都對(duì)氧非常敏感。這一特征使得幾乎不可能 在植物中固氮，因?yàn)橹参镌诠夂献饔梅磻?yīng)期間從水產(chǎn)生氧。藍(lán)細(xì)菌被認(rèn)為是葉綠體的進(jìn)化 祖先（基礎(chǔ)）。盡管葉綠體在進(jìn)化期間已失去許多其原始的基因，但藍(lán)細(xì)菌維持了許多葉 綠體丟失的基因。作為光合生物，藍(lán)細(xì)菌棲息在地球上幾乎所有光照環(huán)境中。它們?cè)谟沙?過20個(gè)固氮（NIF)基因促進(jìn)的生物固氮（BNF)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這些基因中只有三 個(gè)（Nif-D、Nif-K和Nif-H)是NIF酶類（固氮酶）。其余的NIF基因參與復(fù)合體組裝、輔 因子加工和表達(dá)的控制。
[0012] 豆科作物例如大豆、菜豆或豌豆以它們發(fā)育出被根瘤菌（Rhizobiumsp.)共生細(xì) 菌占據(jù)的根瘤的獨(dú)特能力廣為人知。這些細(xì)菌能夠BNF并向植物提供氨。大多數(shù)作物不具 有這種能力，并且根瘤菌（Rhizobiumsp.)不能與它們相互作用。進(jìn)行了幾次未發(fā)表的嘗 試以擴(kuò)展根瘤菌的"宿主"范圍，但所有這些嘗試都失敗了。
[0013] 因此，需要一種系統(tǒng)和方法，其包含能夠以使系統(tǒng)可持續(xù)并且在商業(yè)上可行的顯 著速率進(jìn)行細(xì)胞固氮以生產(chǎn)氨的轉(zhuǎn)基因植物。下面的部分描述這樣的系統(tǒng)。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 本公開涉及被轉(zhuǎn)化以便能夠進(jìn)行自行/自我固氮過程，產(chǎn)生它們自己可用的氮 源，由此降低對(duì)作為氮源的含氮肥料的依賴性的轉(zhuǎn)基因植物（遺傳修飾生物體或（GM0))。 本公開還涉及包含轉(zhuǎn)化這些植物以使它們能夠進(jìn)行自行/自身固氮的基因的植物細(xì)胞、組 織、植物部分或植物株系。
[0016] 在某些實(shí)施方式中，根據(jù)本公開的原理，提供了一種表現(xiàn)出改良的自身/自行固 氮情況的植物，其通過包括下列步驟的方法來產(chǎn)生：將編碼可操作連接到啟動(dòng)子序列和終 止子序列的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的重組核酸序列導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞；從所述 植物細(xì)胞再生一株或多株植物，并選擇從所述植物細(xì)胞培養(yǎng)并表現(xiàn)出增強(qiáng)的固氮的一株或 多株植物，使得一株或多株植物包含編碼Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重組核酸序列。 在某些實(shí)施方式中，編碼Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重組核酸序列從單一生物體獲 得。在某些實(shí)施方式中，編碼Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重組核酸序列從不同生物 體獲得。例如，在某些實(shí)施方式中，編碼Nif-H、Nif-D和Nif-K基因中的至少一個(gè)的重組核 酸序列從第一生物體獲得，并且編碼Nif-H、Nif-D和Nif-K基因中的至少一個(gè)的重組核酸 序列從不同于所述第一物種的第二生物體獲得。在某些實(shí)施方式中，編碼Nif-H、Nif-D和 Nif-K基因的所述重組核酸序列在自然界中存在。在某些實(shí)施方式中，編碼Nif-H、Nif-D和 Nif-K基因的所述重組核酸序列是合成的并且在自然界中沒有被發(fā)現(xiàn)。
[0017] 在某些實(shí)施方式中，根據(jù)本公開的原理，提供了一種表現(xiàn)出改良的自身/自行固 氮情況的植物，其通過包括下列步驟的方法來產(chǎn)生：將植物細(xì)胞與編碼SEQ.ID.N0. 1、SEQ.ID.NO. 2和SEQ.ID.NO. 3之一的重組核酸序列相接觸；從所述植物細(xì)胞再生一株或多株植 物；以及選擇從所述植物細(xì)胞培養(yǎng)的一株或多株植物，其中所選的植物各自表現(xiàn)出增強(qiáng)的 固氮，其中所選的一株或多株植物各自包含編碼SEQ.ID.No. 1、SEQ.ID.No. 2、SEQ.ID.N0. 3、 SEQ.ID.NO. 46、SEQ.ID.NO. 47、SEQ.ID.NO. 48 或SEQ.ID.NO49 的重組核酸序列。
[0018] 在某些實(shí)施方式中，根據(jù)本公開的原理，提供了一種表現(xiàn)出增強(qiáng)的固氮的植物， 其通過包括下列步驟的方法來產(chǎn)生：將植物細(xì)胞與編碼SEQ.ID.N0. 1、SEQ.ID.N0. 2、SEQ. ID.NO. 3、SEQ.ID.NO46、SEQ.ID.NO47、SEQ.ID.NO48 或SEQ.ID.NO. 49 之一的重組核 酸序列相接觸；將所述植物細(xì)胞與被優(yōu)化以用于番茄葉綠體表達(dá)的至少一種合成的編碼 DNA序列（sCDS)相接觸；從所述植物細(xì)胞再生一株或多株植物；以及選擇從所述植物細(xì) 胞培養(yǎng)并表現(xiàn)出增強(qiáng)的固氮的一株或多株植物，其中所述一株或多株植物包含編碼SEQ. ID.N0. 1、SEQ.ID.N0. 2、SEQ.ID.N0. 3、SEQ.ID.N0 46、、SEQ.ID.N0 47、SEQ.ID.N0 48 或 SEQ.ID.NO. 49的所述重組核酸序列和所述s⑶S。
[0019] 在某些實(shí)施方式中，根據(jù)本公開的原理，提供了一種表現(xiàn)出增強(qiáng)的固氮的植物，其 通過包括下列步驟的方法來產(chǎn)生：將一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞與編碼可操作連接到第一啟動(dòng) 子的作為Nif-H基因的帶有植物轉(zhuǎn)運(yùn)肽或葉綠體（質(zhì)體）積累信號(hào)的嵌合Nif基因的重 組核酸序列相接觸；將所述植物細(xì)胞與編碼可操作連接到第二啟動(dòng)子的Nif-D基因的重組 核酸序列相接觸；將所述植物細(xì)胞與編碼可操作連接到第三啟動(dòng)子的Nif-K基因的重組核 酸序列相接觸；從所述植物細(xì)胞再生一株或多株植物；以及選擇從所述植物細(xì)胞培養(yǎng)的一 株或多株植物，其中所選植物各自表現(xiàn)出增強(qiáng)的固氮，其中所選植物各自包含編碼Nif-H 基因的重組核酸序列、編碼Nif-D基因的重組核酸序列和編碼Nif-K基因的重組核酸序 列。在某些實(shí)施方式中，所述Nif-H基因選自基本上由SEQID.N0. 29、SEQID.N0. 32、SEQ ID.NO. 35和SEQID.NO. 38構(gòu)成的組。在某些實(shí)施方式中，所述Nif-D基因選自基本上由 SEQID.N0. 30、SEQID.N0. 33、SEQID.N0. 36 和SEQID.N0. 39 構(gòu)成的組。在某些實(shí)施方 式中，所述Nif-K基因選自基本上由SEQID.NO. 31、SEQID.NO. 34、SEQID.NO. 37 和SEQ ID.NO. 40構(gòu)成的組。在某些實(shí)施方式中，所述第一、第二和第三啟動(dòng)子選自基本上由SEQ.ID.NO. 41-45構(gòu)成的組。
[0020] 本公開還涉及轉(zhuǎn)基因植物來源的商業(yè)化產(chǎn)品，其源自于按照本公開中描述的方法 產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
[0021] 還描述了一種按照本公開的原理降低土壤中的總氮濃度的方法。所述方法包括將 本公開中描述的至少一種轉(zhuǎn)基因植物放置成與將要降低氮水平的土壤相接觸；以及允許所 述植物生長(zhǎng)并固定從所述土壤獲得的氮，它們的代謝引起所述土壤中總氮濃度的降低。這 些以及其他原理使用附圖并在詳細(xì)描述中進(jìn)一步描述。
[0022] 附圖簡(jiǎn)述
[0023] 圖1示出了固氮酶復(fù)合體的示意結(jié)構(gòu)。
[0024]圖2示出了用于在番茄葉綠體轉(zhuǎn)化期間插入到質(zhì)體中的構(gòu)建質(zhì)粒的產(chǎn)生步驟的 示意圖。
[0025] 圖3示出了用于番茄葉綠體轉(zhuǎn)化和Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的表達(dá)的質(zhì)粒（PGE 011)的產(chǎn)生步驟的示意圖。
[0026] 圖4示出了作為單一操縱子被克隆并插入到萊茵衣藻（C.reinhardtii)葉綠體中 的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因。
[0027] 圖5不出了在萌發(fā)后三周時(shí)番前植株的發(fā)育。
[0028] 圖6示出了Nif-H在植物質(zhì)粒中的積累。
[0029] 圖7示出了植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的示意結(jié)構(gòu)。
[0030] 詳細(xì)描述
[0031] 本公開涉及能夠固氮的轉(zhuǎn)基因植物、從這樣的植物生產(chǎn)的產(chǎn)品、產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因 植物的方法和使用所述轉(zhuǎn)基因植物降低土壤或水