用于酶促水解木質(zhì)纖維素材料的方法
【專利說(shuō)明】用于酶促水解木質(zhì)纖維素材料的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于酶促水解木質(zhì)纖維素材料的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 木質(zhì)纖維素植物材料在本文中也稱為原料（feedstock)或含纖維素材料，其是糖 形式的可再生能源，其可被轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的產(chǎn)物，例如生物燃料，例如生物乙醇。該過(guò)程期 間，通過(guò)（半）纖維素分解酶，原料（例如麥秸、玉米桿、稻殼等）中存在的（木質(zhì)或半）纖 維素被轉(zhuǎn)化為還原糖，然后通過(guò)微生物（比如酵母、細(xì)菌和真菌）被轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的產(chǎn)物例 如乙醇。
[0004] 鑒于（半）纖維素是結(jié)晶的并包埋在木質(zhì)素網(wǎng)中，向還原糖的轉(zhuǎn)化通常是慢的且 不完全的。典型地，酶促水解未處理原料產(chǎn)生少于理論量的20%的糖。通過(guò)應(yīng)用化學(xué)和熱 物理預(yù)處理，（半）纖維素對(duì)（半）纖維素分解酶而言更可及，因而轉(zhuǎn)化更快且產(chǎn)率更高。
[0005] 來(lái)自源于經(jīng)預(yù)處理玉米桿的葡萄糖的典型乙醇產(chǎn)率是40加侖乙醇/1000kg干玉 米桿（Badger，P，Ethanol from cellulose ：a general review,Trends in new crops and new uses，2002, J.Janick 和 A. Whipkey (編）ASHS Press，Alexandria，VA)或 0.3g 乙醇 / g原料?；诶w維素的乙醇的最大產(chǎn)率是約90%。
[0006] 纖維素分解酶（它們中的大多由比如Trichoderma、Humicola和Aspergillus的 物種產(chǎn)生）在商業(yè)上被用來(lái)將預(yù)處理的原料轉(zhuǎn)化為含有不可溶的（半）纖維素、其制得的 還原糖以及木質(zhì)素的糊狀物（mash)。然后，這種糊狀物被用在發(fā)酵中，發(fā)酵期間還原糖被轉(zhuǎn) 化為酵母生物質(zhì)（細(xì)胞）、二氧化碳和乙醇。以這種方式產(chǎn)生的乙醇被稱為生物乙醇。
[0007] 從預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)糖的一般生產(chǎn)中，水解（還被稱為 液化、預(yù)糖化或糖化）典型地在45-50 °C的升高的溫度（Kumar，S.，Chem. Eng. Technol. 32(2009)517-526)和非滅菌條件下的持續(xù)6-168小時(shí)的方法中進(jìn)行（Kumar， S. , Chem. Eng. Technol. 32(2009)517-526 ；Murray, P.等人，Enzyme Microbial Technol 29(2001)90-98)。在該水解期間，存在的纖維素被部分（典型地30-95%，可取決于酶活性 和水解條件）轉(zhuǎn)化為還原糖。在酶被預(yù)處理原料中存在的化合物和被釋放的糖抑制的情況 下，以及為了使熱失活最小化，該升高的溫度的時(shí)間盡可能地短。
[0008] 水解后的發(fā)酵在相同或不同容器中在單獨(dú)的厭氧處理步驟中發(fā)生，其中溫度被調(diào) 至30-33°C (嗜溫方法）以適應(yīng)生長(zhǎng)和通過(guò)微生物生物質(zhì)（通常為酵母）生產(chǎn)乙醇。在 該發(fā)酵方法期間，通過(guò)來(lái)自水解步驟的已存在的酶，剩余的（半）纖維素材料被轉(zhuǎn)化為還 原糖，同時(shí)產(chǎn)生微生物生物質(zhì)和乙醇。因此，這種類型的發(fā)酵通常被稱為同時(shí)糖化和發(fā)酵 (Simultaneously Saccharification and Fermentation，SSF) 〇 -旦（半）纖維素材料被 轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖并且所有可發(fā)酵糖被轉(zhuǎn)化為乙醇、二氧化碳和微生物細(xì)胞，發(fā)酵完成。
[0009] 這樣獲得的發(fā)酵糊狀物由非可發(fā)酵糖、非可水解（半）纖維素材料、木質(zhì)素、微生 物細(xì)胞（最通常為酵母細(xì)胞）、水、乙醇、溶解的二氧化碳組成。在連續(xù)步驟中，從糊狀物中 蒸餾并進(jìn)一步純化乙醇。剩余的固體懸浮物被干燥并被用作例如燃燒燃料、肥料或牛飼料。
[0010] 就每批原料而言，添加酶以使給定的處理時(shí)間期間從預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料釋 放可發(fā)酵糖的產(chǎn)率和速率最大化。通常，生產(chǎn)酶的成本、原料到乙醇的產(chǎn)率和投資是總生產(chǎn) 成本中的主要成本因素（Kumar，S.Chem. Eng. Technol. 32(2009)517-526)。迄今為止，通過(guò) 應(yīng)用來(lái)自單一微生物來(lái)源或來(lái)自多種微生物來(lái)源（W0 2008/008793)的具有更寬和/或更 高（特異性）水解活性的酶產(chǎn)物來(lái)實(shí)現(xiàn)酶使用成本降低，使用所述酶目的在于更低的酶需 求、更快的轉(zhuǎn)化速率和/或更高的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率和因而總體上更低的生物乙醇生產(chǎn)成本。這需 要在研宄和開(kāi)發(fā)這些酶產(chǎn)物中的大量投資。在由來(lái)自多種微生物來(lái)源的酶構(gòu)成的酶產(chǎn)物情 況下，生產(chǎn)各單個(gè)酶化合物需要大的資本投資。
[0011] 因此期望改進(jìn)涉及水解和發(fā)酵的上述方法。
[0012] 來(lái)源于Talaromyces的熱穩(wěn)定纖維素分解酶已被用于降解木質(zhì)纖維素原料，已知 這些酶具有熱穩(wěn)定性（在W02007091231中）。然而，沒(méi)有給出怎樣優(yōu)化水解和發(fā)酵方法的 公開(kāi)。
[0013] 發(fā)明概沐
[0014] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于水解含纖維素的生物質(zhì)的方法，其包括：
[0015]-液化步驟，其中加入第一酶或第一酶組合物以液化所述生物質(zhì)中存在的至少部 分固體并在所述液化步驟中將所述含纖維素的生物質(zhì)的粘度保持在低于lOOOcP、優(yōu)選地低 于800cP、更優(yōu)選地低于600cP;然后
[0016]-糖化步驟，其中加入第二酶組合物以形成低聚糖和/或單體糖；以及
[0017] 其中，所述第一酶或第一酶組合物與所述第二酶組合物不同；
[0018] 其中，所述第一酶或第一酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶；
[0019] 其中，所述第二酶組合物包含纖維素酶；和
[0020] 其中，所述第一酶或第一酶組合物比所述第二酶組合物包含更多的內(nèi)切葡聚糖酶 (以蛋白質(zhì)重量％表示）。
[0021] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于水解含纖維素的生物質(zhì)的方法，其包括：
[0022] -液化步驟，其中加入第一酶或第一酶組合物以液化所述生物質(zhì)中存在的至少部 分固體并在所述液化步驟中獲得至少2、至少4、至少6、至少10、至少15或至少20的粘度 降低因子（viscosity reduction factor);然后
[0023]-糖化步驟，其中加入第二酶組合物以形成低聚糖和/或單體糖；以及
[0024] 其中，所述第一酶或第一酶組合物與所述第二酶組合物不同；
[0025] 其中，所述第一酶或第一酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶；
[0026] 其中，所述第二酶組合物包含纖維素酶；和
[0027] 其中，所述第一酶或第一酶組合物比所述第二酶組合物包含更多的內(nèi)切葡聚糖酶 (以蛋白質(zhì)重量％表示）。
[0028] 優(yōu)選地，液化步驟發(fā)生在這樣的反應(yīng)器（液化反應(yīng)器）中，其體積小于糖化步驟所 發(fā)生的反應(yīng)器（糖化反應(yīng)器）的體積，優(yōu)選地，所述液化反應(yīng)器的體積與所述糖化反應(yīng)器的 體積的比率在1 : 2和1 : 50之間，更優(yōu)選地在1 : 3和1 : 40之間。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，液化反應(yīng)器和/或糖化反應(yīng)器的體積大于lm3,優(yōu)選地體 積在10-5000m3之間。
[0030]有利地，與形成低聚糖和/或單體糖的步驟中或單體糖水解反應(yīng)器中相比，在液 化步驟中或在液化反應(yīng)器中，每反應(yīng)器體積加入較少的酶（基于蛋白質(zhì)干物質(zhì)）。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，第二酶組合物包含至少兩種不同的纖維二糖水解酶和任 選地0 _葡糖苷酶和/或GH61。
[0032] 優(yōu)選地，第一酶或第一酶組合物和/或第二酶或酶組合物包含熱穩(wěn)定酶。
[0033] 根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，以補(bǔ)料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式，更優(yōu)選地以連續(xù)模式 完成液化步驟。
[0034] 根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，以補(bǔ)料分批、半連續(xù)或分批模式，更優(yōu)選地以分批或 補(bǔ)料分批模式完成糖化步驟。
[0035] 在液化步驟中，優(yōu)選地維持干物質(zhì)含量為5重量％或更高、8重量％或更高、10重 量％或更高、11重量％或更高、12重量％或更高、13重量％或更高、14重量％或更高、15重 量％或更高、20重量％或更高、25重量％或更高、30重量％或更高、35重量％或更高或40 重量％或更高，以及優(yōu)選地低于42重量％。
[0036] 優(yōu)選地，液化步驟在50°C或更高、55°C或更高、60°C或更高、65°C或更高、或者 70°C或更高的溫度下進(jìn)行；更優(yōu)選地，液化步驟在65°C -110°C之間、甚至更優(yōu)選地在 65°C -90°C之間、仍然更優(yōu)選地在65°C -80°C之間且最優(yōu)選地在70°C -80°C之間的溫度下進(jìn) 行。
[0037] 附圖簡(jiǎn)沐
[0038] 圖1:利用內(nèi)切葡聚糖酶預(yù)液化的效果。
[0039] 圖2:在不同溫度（（?=62°C，A=70°C，#=75°C)下，木質(zhì)纖維素原料液化期 間的粘度下降。
[0040] 發(fā)明詳沐
[0041] 本發(fā)明涉及在水解含纖維素的生物質(zhì)的方法中降低操作成本，例如酶成本、反應(yīng) 器成本和能量成本。可通過(guò)使用較少酶來(lái)降低酶成本并同時(shí)維持高生產(chǎn)結(jié)果例如高水平的 糖、乙醇、生物氣或其它期望產(chǎn)物（全部與已知水解工藝相比）?？赏ㄟ^(guò)選擇導(dǎo)致與已知水 解工藝相比較小的總反應(yīng)器體積的工藝條件來(lái)降低反應(yīng)器成本。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)至本發(fā) 明方法的能量供應(yīng)需要較低可實(shí)現(xiàn)節(jié)能。
[0042] 太質(zhì)纖維素材料
[0043] 本文中的木質(zhì)纖維素材料包括任何木質(zhì)纖維素材料和/或半纖維素材料。適于 用作本發(fā)明原料或含纖維素材料的木質(zhì)纖維素材料包括生物質(zhì)，例如原初生物質(zhì)（virgin biomass)和/或非原初生物質(zhì)如農(nóng)業(yè)生物質(zhì)，商業(yè)有機(jī)物，建筑和拆除碎片，市政固體廢棄 物，廢紙和庭院廢棄物。常見(jiàn)的生物質(zhì)形式包括樹木，灌木叢（shrubs)和草，小麥，麥秸， 甘鹿澄，柳枝稷，芒草（miscanthus)，玉米，玉米桿（corn stover)，玉米殼，玉米芯（corn cobs)，蕓苔莖，大豆莖，高粱，玉米粒（包括來(lái)自玉米粒的纖維），來(lái)自谷物如玉米、小麥和 大麥研磨（包括濕磨和干磨）的通常稱作"麩或纖維"的產(chǎn)物和副產(chǎn)物，以及市政固體廢 棄物，廢紙和庭院廢棄物。生物質(zhì)也可以是但不限于草本材料，農(nóng)業(yè)殘余物，林業(yè)殘余物， 市政固體廢棄物，廢紙，和漿和造紙廠殘余物。"農(nóng)業(yè)生物質(zhì)"包括樹枝，灌木（bushes)，藤 蔓（canes)，玉米和玉米殼，能量作物，森林，水果，花，谷物，草，草本作物，葉，樹皮，針葉，原 木，根，樹苗，短期輪種木本作物（short-rotation woody crops)，灌木叢，柳枝稷，樹木，蔬 菜，水果皮，蔓藤（vines)，甜菜衆(zhòng)，小麥麩皮(wheat midiings)，燕麥殼，和硬木材和軟木材 (不包括帶有有害材料的木材）。另外，農(nóng)業(yè)生物質(zhì)包括由農(nóng)業(yè)加工產(chǎn)生的有機(jī)廢棄物材 料，所述農(nóng)業(yè)加工包括農(nóng)業(yè)和林業(yè)活動(dòng)，尤其包括林業(yè)木材廢棄物。農(nóng)業(yè)生物質(zhì)可以是前述 任一或其任何組合或混合物。
[0044] 預(yù)處理
[0045] 任選地，原料可以以本領(lǐng)域中已知的任何方式用熱、機(jī)械、微生物、酶促和/或化 學(xué)改性或這些方法的任何組合預(yù)處理，以增強(qiáng)底物對(duì)酶促水解的可及性和/或水解半纖維 素和/或使半纖維素和/或纖維素和/或木質(zhì)素溶解。在一種實(shí)施方式中，通過(guò)用蒸汽噴 發(fā)、熱水處理或用稀酸或稀堿處理