一種新的鹿角海蘿多糖的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域。更具體地，涉及一種鹿角海蘿多糖及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 海藻多糖是一類混合物，是海藻細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)所含的各種高分子碳水化合物的 總稱，在海藻中含量豐富，約占干重的20~70%。依據(jù)來源海藻的不同，可分為褐藻多糖、紅 藻多糖、綠藻多糖等。越來越多的研宄證明多糖具有復(fù)雜的多方面的生物活性和功能，特別 是對(duì)機(jī)體免疫功能的作用。
[0003] 鹿角海蘿（Gloiopeltis furcata)，紅藻門（Rhodophyta)真紅藻綱 (Florideophyceae)隱絲藻目（Cryptonemiales)內(nèi)枝藻科（Endocladiaceae)海蘿屬 (Gloipeltis J.Agardh)，俗名赤菜，為一年生紅藻。國內(nèi)外的科研工作者研宄相繼發(fā)現(xiàn)海 蘿多糖具有廣泛的藥理活性，是一種重要的海洋藥物資源。例如，許實(shí)波等人研宄表明海 蘿水提取物能延長小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間、延長出血和血凝時(shí)間、提高體液免疫和細(xì)胞 免疫功能、抗腫瘤；說明海蘿提取物可望開發(fā)為保健食品，但進(jìn)一步的藥理研宄還待進(jìn)行。 D. L. Ren研宄結(jié)果表明，鹿角海蘿多糖具有相似于PSK的抗腫瘤和免疫增強(qiáng)作用。該抗腫 瘤作用可能與增加輔助T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、NK細(xì)胞和增強(qiáng)DTH反應(yīng)相關(guān)，它的免疫活 性與抗腫瘤活性之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研宄。汕頭大學(xué)余杰等人用海蘿多糖粗提物灌胃昆 明種小鼠，觀察海蘿多糖粗提物（CP)對(duì)環(huán)磷酰胺誘發(fā)小鼠染色體突變和精子畸變的抑制作 用和對(duì)荷S180肉瘤小鼠的抑瘤作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，海蘿多糖粗提物可使環(huán)磷酰胺誘發(fā)的 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞（PCE)微核率和精子畸形率明顯降低，具有顯著的抗突變作用，且呈 現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系；海蘿粗多糖對(duì)S180肉瘤也有明顯的抑制作用，并有一定的劑量關(guān) 系。其中，也建立H22實(shí)體肝癌腫瘤模型，以海蘿多糖連續(xù)灌胃治療，觀察海蘿多糖的抑瘤 作用，并測定脾臟、胸腺和肝臟等器官的器官系數(shù)，分析血清抗H22抗體水平和谷丙轉(zhuǎn)氛酶 (GPT )及肝組織谷丙轉(zhuǎn)氛酶（GPT )、谷草轉(zhuǎn)氛酶（GOT )、丙二醛(MDA )水平以及超氧化物歧化 酶（SOD)活性等生理生化指標(biāo)，研宄海蘿多糖（GFP)對(duì)H22移植性腫瘤的抑瘤作用并探討其 抗種瘤機(jī)理。結(jié)果顯示，海蘿多糖200和400mg · kg4 · Cf1灌胃7d，使給藥組抑瘤率分別達(dá) 到35. 64% (P〈0. 01)和36. 63% (P〈0. 01)，海蘿多糖具有一定的抗移植性小鼠 H22肝腫瘤作 用。其抗腫瘤的機(jī)理可能是通過增強(qiáng)機(jī)體的特異性免疫、增加血清抗腫瘤抗體水平和增強(qiáng) 機(jī)體清除自由基的能力來實(shí)現(xiàn)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)海蘿多糖具有保護(hù)荷瘤小鼠肝臟的作用。
[0004] 近年來多糖類物質(zhì)的研宄取得了很大的進(jìn)展，但與蛋白質(zhì)、核酸的研宄相比還有 很大差距，并且不夠深入，主要有以下方面的問題：多糖的構(gòu)效關(guān)系不明確，現(xiàn)已初步認(rèn)為 多糖的生物活性與其一級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)、分子量、溶解度等有關(guān)，但缺乏規(guī)律性的科學(xué)依 據(jù)和結(jié)論，大多還是推測和分析，而對(duì)多糖的溶液構(gòu)象和晶體研宄幾乎是空白。對(duì)多糖在體 內(nèi)的作用機(jī)制研宄不夠深入，有關(guān)多糖在體內(nèi)代謝的研宄甚少，還不十分明確多糖在體內(nèi) 代謝的途徑。多糖的多種生物活性雖已被實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，但多糖在生物體內(nèi)真正的作用機(jī)制 還未闡明，多糖在細(xì)胞膜或脂質(zhì)體表面的構(gòu)象和作用、多糖和磷脂及蛋白締合的化學(xué)和物 理進(jìn)程及它們所形成的微環(huán)境與它們的生物功能之間的關(guān)系等都還不十分清楚，有待進(jìn)一 步深入研宄。
[0005] 更主要的原因在于，多糖的制備、結(jié)構(gòu)測定和合成較為困難，由于多糖不是一個(gè)單 一物質(zhì)，而是有一定分子量分布的混合物，很難得到其晶體；多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)隨著單糖種 類、糖苷類型、構(gòu)象、分枝度、取代基的不同而有很大的變化，使一級(jí)結(jié)構(gòu)的測定有很大的困 難，而多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜；這些因素使多糖在發(fā)揮作用時(shí)的構(gòu)象研宄、多糖的合成等 方面造成了很大的困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有海蘿藻多糖及其結(jié)構(gòu)研宄的技術(shù)不足，提供 一種新的鹿角海蘿多糖，公開了鹿角海蘿多糖的結(jié)構(gòu)組成及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明另一目的是提供鹿角海蘿多糖在抗腫瘤方面的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明公開了一種新的鹿角海蘿多糖，所述鹿角海蘿多糖的重均相對(duì)平均分子量為 7. 72E+04,且由葡萄糖-6-硫酸基-β -D-半乳糖（1 - 4)-3,6-內(nèi)醚-a -L-半乳糖（1 - 3) 重復(fù)結(jié)構(gòu)構(gòu)成。所述的鹿角海蘿多糖中葡萄糖和半乳糖的摩爾比為1:1.86。
[0009] 本發(fā)明上述鹿角海蘿多糖是由如下方法制備得到： 51. 用乙醇對(duì)鹿角海蘿干粉進(jìn)行脫脂除色后，油浴4h ;再用無水乙醇處理過夜后，沉淀 依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，烘干得鹿角海蘿粗多糖； 52. 鹿角海蘿粗多糖經(jīng)木瓜蛋白酶酶解后，加入三氯乙酸過夜，去沉淀，中和，透析，濃 縮，干燥得鹿角海蘿精多糖； 53. 用DEAE-瓊脂糖凝膠柱和G-100凝膠柱層析，對(duì)鹿角海蘿精多糖分離提純得鹿角海 蘿純多糖，即權(quán)利要求1所述鹿角海蘿多糖。
[0010] 具體地，所述鹿角海蘿多糖是由如下方法制備得到： 51. 提取鹿角海蘿粗多糖： SI 1.取鹿角海蘿干粉，加入15~20倍體積的70~80v/v%乙醇進(jìn)行脫脂除色，加熱， 控制溫度在70~90 °C，料液比為1 : 40~1 : 60條件下油浴4h : 512. 將Sll得到的溶液離心，上清液濃縮后，加入3~4倍體積的無水乙醇，4~6 °C 放置過夜； 513. 將S12得到的溶液離心，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，烘干，得鹿角 海蘿粗多糖（CP); 52. 獲得鹿角海蘿精多糖： 521. 鹿角海蘿粗多糖經(jīng)木瓜蛋白酶酶解后，加入三氯乙酸，4~6°C過夜，去沉淀； 522. 將S21去沉淀后的溶液加堿中和，透析，濃縮透析液，冷凍干燥，得灰白色網(wǎng)狀的 鹿角海蘿精多糖（RP); 53. 分離純化鹿角海蘿純多糖： 531. 將鹿角海蘿精多糖上DEAE-瓊脂糖凝膠柱，水洗、鹽洗、濃縮、除鹽、干燥，經(jīng)G-100 凝膠柱層析，檢測收集得到純多糖流份； 532. 濃縮、冷凍干燥，得鹿角海蘿純多糖（PP)，即權(quán)利要求1所述鹿角海蘿多糖。
[0011] 其中，優(yōu)選地，步驟S12所述離心為1500~3000 rpm離心10~15min ; 步驟S12所述濃縮是在50~60°C條件下，將上清液濃縮至原體積的1/5~1/6 ; 步驟S13所述離心為3000~4000 rpm離心10~15min ; 步驟S13所述烘干為50~60°C烘干至無乙醚味。
[0012] 優(yōu)選地，步驟S21所述酶解是在pH 6. 8~7. 0條件下，使用終濃度為1~I. 5w/v% 的木瓜蛋白酶，50~60°C酶解反應(yīng)2~3 h，再升溫至90~100°C后終止反應(yīng)。
[0013] 優(yōu)選地，步驟S21所述三氯乙酸的體積濃度為4~5%，三氯乙酸與鹿角海蘿粗多 糖溶液的體積比為1:1~1:1. 2 ;步驟S22所述濃縮為50~60 °C濃縮至原液體積的1/15 ~1/16〇
[0014] 另外，更具體地，步驟S2的具體操作條件為： 按照鹿角海蘿粗多糖與蒸餾水質(zhì)量體積比為1~2 :100~200 g/mL的比例，將取鹿角 海蘿粗多糖（CP)全部溶于蒸餾水中，加入終濃度為1~I. 5w/v%的木瓜蛋白酶，控制酶解 溫度為50~60°C，溶液的pH為6. 8~7. 0,酶解2~3 h后升高溫度至90~100°C后終止 反應(yīng)； 按照1:1~1:1. 2的體積比，在上述反應(yīng)后的溶液中加入三氯乙酸，攪拌均勻，4~6°C 過夜，去沉淀，加入2~4 mol/L NaOH中和，透析，收集透析液于50~60°C濃縮至原液1/15 ~1/16,冷凍干燥，得鹿角海蘿精多糖（RP); 步驟S3的具體操作條件為： 取15~20 mg/mL的鹿角海蘿精多糖（RP)溶液10~15mL，上DEAE-瓊脂糖凝膠柱 CL-6B( Φ 2. 6cm，30cm)，先用蒸餾水洗1. 5~2倍柱體積，再分別用200~300 mL的0. 1~ 0. 75mol/L NaCl進(jìn)行梯度洗脫，流速為1. 5~2 mL/min，收集多糖組分用50~60°C水浴 濃縮、雙蒸水透析、除鹽(透析分子量為8000-10000)，再50~60°C水浴濃縮，冷凍干燥得多 糖；將所得多糖溶于蒸餾水中繼續(xù)經(jīng)S印hadex G-100柱（Φ 2. 6cm，30cm)，以蒸餾水為流動(dòng) 相純化，流速0. 1~0. 2 mL/min，檢測收集純多糖流份，濃縮、冷凍干燥，得鹿角海蘿純多糖 (PP)，即本發(fā)明所述的鹿角海蘿多糖。
[0015] 作為一種最優(yōu)選的方案，可以采用以下方法進(jìn)行步驟S2和S3 : 步驟S2 :鹿角海蘿粗多糖（CP)Ig溶于IOOmL蒸餾水中，待粗多糖全部溶解后加入木瓜 蛋白酶使終濃度為1%，55°C pH7.0反應(yīng)2h，升高溫度至100°C后終止反應(yīng)。酶解后按照 1:1的體積比加入5%三氯乙酸（TCA)，攪拌均勻，4°C過夜，去沉淀，2mol