一種凹土負載黑布林籽β-葡萄糖苷酶交聯聚合物合成紅景天苷的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于固定化酶生產領域，涉及催化合成紅景天苷的方法，具體涉及一種凹土負載黑布林籽β-葡萄糖苷酶交聯聚合物合成紅景天苷的方法。
【背景技術】
[0002]紅景天一般生長于歐亞兩州高原地帶，為景天科多年生草本或亞灌木植物，具有“高原人參”的美譽。全世界共有紅景天屬植物96種，主要分布與東亞、中亞、西伯利亞和北美地區(qū)。我國有73種，主要分布于西南、西北、華北和東北地區(qū)。紅景天的主要有效成分為紅景天苷，化學名對羥基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，是目前研宄最多的紅景天中的主要活性成分，是評價紅景天品質的主要評價指標。紅景天苷具有顯著的生物學活性，其效果優(yōu)于常用的人參和刺五加等中藥，在清除機體內過多自由基、抗缺氧、抗衰老、抗心肌缺血、提高機體免疫力等方面具有顯著效果，因此能同時發(fā)揮防輻射和抗疲勞的雙重作用。
[0003]紅景天苷的來源目前主要有三種途徑，第一為植物來源；第二為化學合成；第三為酶法合成。2004年，Tong等利用蘋果籽粉β-葡萄糖苷酶以對羥基苯乙醇和葡萄糖為底物首次進行了合成，反應完成后紅景天苷濃度可達11.8g/L，高于化學合成法與植物來源法。因此，酶法成為合成紅景天苷的一種有效方法。葡萄糖苷酶廣泛地存在于自然界中，在微生物及動植物的體內都發(fā)現有該酶的存在。目前，葡萄糖苷酶可應用于改善飲用酒水的風味、生產低聚龍膽糖、水解大豆異黃酮、合成糖苷類化合物以及降解纖維素。但是目前植物來源的葡萄糖苷酶主要是來自于苦杏仁，其價格較高且產量有限，不利于大規(guī)模生產應用。
[0004]在實際應用中，游離的酶對外界因素的抗煩擾能力較弱且難于回收利用，而酶的固定化技術作為提高酶穩(wěn)定性和重復利用性的主要工程手段被廣泛地研宄和使用。用于固定化的載體材料有很多，包括天然高分子材料、合成高分子材料、無機材料以及復合材料等，其中凹土(又被稱作凹凸棒土)是一種無機材料，其主要成分是一種多孔型鏈層狀鎂鋁硅酸鹽類黏土礦物。凹土這種無機礦物，不僅價廉易得，而且具備機械強度高、熱穩(wěn)定性好、抗有機溶劑、抗微生物腐蝕等優(yōu)點。交聯酶聚合物的制備不需要對酶進行繁瑣而復雜的結晶過程，其制備過程簡單，原料廉價。綜合利用凹土吸附及交聯酶聚合物制備的方法可有效地提高固定化酶的穩(wěn)定性及機械強度，為其提供更廣闊的應用空間。
[0005]在固定化酶的技術中，凹土作為酶的載體被廣泛使用。申請?zhí)枮镃N201110064051的專利“一種基于辣根過氧化物酶-凹土納米復合材料的細胞內過氧化氫的檢測方法”，公開號為CN102719498A的專利“有機改性凹凸棒土固載脂肪酶催化劑制備生物柴油的方法”，申請?zhí)枮镃N201110350307的專利“一種用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶的制備方法”等專利將凹土用于不同酶的固定化，都獲得了良好的應用效果。凹土為各種酶的固定化，提供了一種優(yōu)良的載體。目前用于合成紅景天苷的葡萄糖苷酶并不多見，且產物紅景天苷的濃度依然較低，酶活回收率較低，成本高，無法滿足工業(yè)化生產對經濟利益最大化的需求，因此，開發(fā)具有更高效率的用于合成紅景天苷的β-葡萄糖苷酶以及利用該酶摸索最佳反應條件及具有極大地市場應用價值。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明目的在于針對現有技術中存在的上述缺點，提供一種凹土負載黑布林籽β -葡萄糖苷酶交聯聚合物合成紅景天苷的方法，首先自黑布林籽中提取β -葡萄糖苷酶酶液，然后利用吸附-交聯法制備凹土負載黑布林籽β-葡萄糖苷酶交聯聚合物，最后利用制備的凹土負載黑布林籽β -葡萄糖苷酶交聯聚合物催化合成紅景天苷，具有高酶活回收率、良好的穩(wěn)定性及重復使用性，同時具有產物紅景天苷的濃度較高的優(yōu)點。
[0007]為實現上述目的，本發(fā)明采取如下技術方案:
本發(fā)明一種凹土負載黑布林籽β-葡萄糖苷酶交聯聚合物合成紅景天苷的方法，包括提取黑布林籽β -葡萄糖苷酶酶液、吸附-交聯法制備凹土負載黑布林籽β -葡萄糖苷酶交聯聚合物和催化合成紅景天苷三部分。
[0008]上述凹土負載黑布林籽β -葡萄糖苷酶交聯聚合物合成紅景天苷的方法，步驟包括:
(1)提取黑布林籽β-葡萄糖苷酶酶液:
1)將黑布林籽去殼、破壁粉碎，得粒徑100目的黑布林籽粉，然后按照50g/L加入ΡΗ5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，再加入占黑布林籽粉質量分數I?2%的果膠酶，混合均勻，于40°C恒溫震蕩培養(yǎng)I?2h，所得溶液離心分離，取上清液真空冷凍干燥，磨粉過60目篩，得干粉;
2)步驟I)干粉中加入25?50倍干粉體積的抽提液，4°C下，攪拌Ih，離心分離，收集提取液，加入提取液質量40%的硫酸銨粉末，攪拌30 min，再次離心分離，取上清液，加入上清液質量65%的硫酸銨粉末，攪拌30 min,第三次離心分離，將第三次離心分離的沉淀溶于緩沖液，溶解濃度為2.65?4.2g/L,靜置10?12h，3kDa超濾膜過濾，得到黑布林籽β -葡萄糖苷酶酶液；
(2)吸附-交聯法制備凹土負載黑布林籽β-葡萄糖苷酶交聯聚合物:
向步驟(I)黑布林籽β-葡萄糖苷酶酶液中加入酸改性的凹土，黑布林籽β-葡萄糖苷酶與酸改性的凹土質量比為1:20?30，再加入黑布林籽β -葡萄糖苷酶質量0.2%的微晶纖維素，攪拌0.5?Ih ;然后加入沉淀劑，沉淀劑與黑布林籽β -葡萄糖苷酶酶液的體積比為2?4:1，攪拌10?15 min ;然后加入戊二醛，戊二醛加入終濃度為20?40 mmol/L ；8~10°C攪拌交聯固化I?2h ;向反應體系中加入蒸餾水終止反應，8000?10000 rpm離心10?15 min，沉淀為凹土負載黑布林籽β -葡萄糖苷酶交聯聚合物，4°C保存，備用；
(3)催化合成紅景天苷:
磷酸鹽緩沖溶液和叔丁醇按照體積比1:4配制混合溶液，然后加入葡萄糖和對羥基苯乙醇，加入濃度分別為0.25mol/L和2.5mol/L,混合均勻，50°C預熱30 min ;加入葡萄糖等質量的凹土負載黑布林籽β-葡萄糖苷酶交聯聚合物，混勻，密閉，于恒溫振蕩器內反應，轉速200 rpm，45?55°C反應70?75 h，收集反應液，離心分離，清液即為產物紅景天苷。
[0009]步驟(I)中，所述的抽提液為磷酸鹽緩沖溶液，濃度為50 mM，pH為7.4 ;
步驟(I)中，溶解沉淀的緩沖液為Tris-HCl緩沖液，濃度為20 mM，pH為7.4 ; 步驟(I)中，制得的黑布林籽β -葡萄糖苷酶酶液的濃度為2.5?4.0g/L ;
步驟(2)中，所述的酸改性的凹土，改性方法為:凹土與2 mol/L的HCl溶液混合，混合濃度0.5g/ml，攪拌12 h，過濾，去離子水洗滌至無Cl —離子，室溫真空干燥；
步驟(2)中，沉淀劑為經-20°C預冷的95%乙醇；
步驟(2)中，蒸餾水的體積為整個反應體系體積的5?10倍；
步驟(I)和(2)中，所述的攪拌轉速為30r/min ；
步驟(3)中，所述的磷酸鹽緩沖溶液，PH為6.0 ;
步驟(3)中，所述的反應，優(yōu)選50°C反應72 ho
[0010]本發(fā)明方法中，反應后凹土負載黑布林籽β-葡萄糖苷酶交聯聚合物可回收，回收處理方式為:收集反應液離心分離出的沉淀，首先用濃度為20 mM，pH為7.4的Tris-HCl緩沖液洗滌3次，再加入1.0 mLPH為6.5的磷酸鹽緩沖溶液，振蕩使之成為懸濁液，靜置10h，離心分離，沉淀為回收的凹土負載黑布林籽β-葡萄糖苷酶交聯聚合物。
[0011]本發(fā)明凹土負載黑布林籽β-葡萄糖苷酶交聯聚合物合成紅景天苷的方法，其有?效果是:
1)本發(fā)明采用了食品加工過程中廢棄的黑布林籽作為β-葡萄糖苷酶的提取原料，產量大、價格低、易獲取，對這些果核回收再利用，可減少環(huán)境污染，實現低碳、綠色循環(huán)經濟；
2)凹土負載黑布林籽葡萄糖苷酶交聯聚合物代替游離酶，酶活回收率提高，對環(huán)境的耐受度也有明顯提高。制備時凹土經過酸改性，戊二醛作用，得到酶蛋白單位濃度較高的固定化酶，同時通過添加微晶纖維素使其具有穩(wěn)定性好、機械強度高、回收利用次數高的特點。
[0012]3)本發(fā)明凹土負載黑布林籽葡萄糖苷酶交聯聚合物催化合成產物紅景天苷的濃度較高，凹土負載黑布林籽β -葡萄糖苷酶交聯聚合物可回收使用，明顯提高了酶的利用率，降低了生產成本。此外，反應后凹土負載黑布林籽葡萄糖苷酶交聯聚合物經離心即可分離，降低了產物的分離難度