一種快速檢測奶源動物以及原料乳中金黃色葡萄球菌的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測奶源動物以及原料乳中致病性金黃色葡萄球菌的試劑盒及 其檢測方法，屬于微生物檢測技術(shù)，適用于奶源動物致病性金黃色葡萄球菌感染以及原料 乳中致病性金黃色葡萄球菌污染的定性檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，簡稱SA)，也稱"金葡菌"，是一種革蘭 氏染色陽性球菌，直徑〇. 8 μ m，在顯微鏡下排列成葡萄串狀。金葡菌在自然界中無處不在， 空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可以找到，是引起細(xì)菌性食物中毒的主要病原菌之 一，且在國家鮮乳標(biāo)準(zhǔn)中列為不得檢出的項目。并且金葡菌也是引起慢性/隱性奶牛乳房 炎的主要病原菌之一，可以極大的影響牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量，給奶制品產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟 損失。因此檢測牛奶中的金葡菌不僅是保證食品安全的需要，同時也可以應(yīng)用于監(jiān)測奶牛 的健康程度，從根本上提高奶牛產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。
[0003] 金黃色葡萄球菌在致病過程中產(chǎn)生多種毒力因子，包括蛋白毒素和莢膜多糖，其 中一種重要的蛋白毒素是α-毒素（也稱α溶血素），它是由大多數(shù)金黃色葡萄球菌致病 菌株產(chǎn)生的，能夠在宿主細(xì)胞膜上打孔并產(chǎn)生溶血的胞外蛋白。多年的研宄表明，各種動物 和人的紅細(xì)胞、血小板、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞和上皮細(xì)胞等都容易受α -毒素溶血 效應(yīng)的影響。另外本實驗室的研宄涉及到從不同地區(qū)患有臨床型或者隱型乳房炎的奶牛所 產(chǎn)的牛奶里分離金葡菌，并通過檢測這些菌株，證明alpha-toxin基因廣泛存在于這些不 同基因型、血清型的金葡菌中，且基因高度保守。
[0004] 在檢測牛奶中所含金葡菌的方法上，目前國內(nèi)外主要采用FDA、A0AC、ISO和GB等 標(biāo)準(zhǔn)對金葡菌進行檢測，整個過程一般需要3-5天，且操作復(fù)雜，已經(jīng)不能滿足微生物快速 準(zhǔn)確檢測的現(xiàn)實需要。因此，迫切需要建立新的快速檢測技術(shù)和方法。
[0005] 近年來，免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方法的發(fā)展和應(yīng)用，使金葡菌的快速檢測有了很 大發(fā)展。但是，免疫學(xué)方法如ELISA、膠體金等，在成本、敏感性等方面尚不理想；而分子生 物學(xué)檢測，如PCR、分子探針等，操作簡便、敏感性高、特異性強，已經(jīng)被越來越多的應(yīng)用?，F(xiàn) 在市場上大多數(shù)檢測金葡菌的PCR或者分子探針方法所采用的引物一般是根據(jù)耐熱核酸 酶（nuc)基因、細(xì)菌16S rRNA或者23S rRNA基因設(shè)計的，而這些檢測方法并不能直接反 映所檢測出的金葡菌的毒力。因此通過檢測alpha-toxin基因能夠更好的檢測出牛奶中是 否存在致病性強的金黃色葡萄球菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于建立一種從牛奶中直接分離病原微生物的快捷方法，再結(jié)合使 用針對alpha-toxin基因設(shè)計的3對特異引物，通過PCR方法檢測alpha-toxin基因，從而 達(dá)到快速檢測牛奶中是否存在致病性金葡菌的目的。
[0007] 本發(fā)明還進一步提供了利用該檢測方法在制備從牛奶中檢測致病性金葡菌的檢 測試劑盒的應(yīng)用，該試劑盒可用于奶源動物以及原料乳中致病性金葡菌的檢測，檢測方法 簡便快捷，適用于工業(yè)化需要。該試劑盒包括：（1)牛奶中微生物的提取試劑：Pecoll溶液 1，密度為 I. 050g/mL ;Pecoll 溶液 2,密度為 I. 123g/mL ;NaCl 溶液，濃度為 0. 15M ; (2)PCR 檢測試劑：2XTaq DNA MasterMix ;ddH20以及3對alpha-toxin基因的引物；⑶陽性對 照：金葡菌基因組DNA ;⑷陰性對照：大腸桿菌基因組DNA ; (5)空白質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；CldH2O。其 中：
[0008] 3對引物是根據(jù)金葡菌的alpha-toxin基因設(shè)計的，所述alpha-toxin基因序列如 SEQ ID NO. 1所示。引物序列如下：
[0009] 第一對引物：
[0010] Fl :5' -ACGGTAATGTTACTGGTGATGA-3'（SEQ ID NO. 2)
[0011] Rl :5' -CTGTAGCGAAGTCTGGTGAA-3'（SEQ ID NO. 3)
[0012] 第二對引物：
[0013] F2 :5' -GGTGCAAATGTTTCGATTGGTC-3'（SEQ ID NO. 4)
[0014] R2 :5' -GCGAAGTCTGGTGAAAACCC-3'（SEQ ID NO. 5)
[0015] 第三對引物：
[0016] F3 :5' -TCCTGTCGCTAATGCCGCAGA-3'（SEQ ID NO. 6)
[0017] R3 :5' -TGCACCAATAAGGCCACCAA-3'（SEQ ID NO. 7)
[0018] 陽性對照是采用本實驗室用國標(biāo)法分離鑒定的高致病性金黃色葡萄球菌株中提 取的基因組DNA。
[0019] 陰性對照是采用本實驗室從BL21大腸桿菌株中提取的基因組DNA。
[0020] 本發(fā)明所提供的具體檢測方法：
[0021] (1)提取牛奶中的微生物：
[0022] 1)取待檢牛奶樣品與Percoll溶液1按0· 5~I : 1的體積比混勾，室溫4, 500g 離心15min，棄去上層懸浮物；
[0023] 2)配制Pecoll梯度溶液：按I : 1的體積比將Percoll溶液1緩慢加 Percoll溶 液2上層，注意不要沖動下層梯度；
[0024] 3)將步驟1)中所得物緩緩加入到步驟2)中準(zhǔn)備好的Percoll梯度溶液的表面 上，室溫14, OOOg離心5min，小心收集上層乳白色溶液；
[0025] 4)將步驟3)中的所得物按0. 3~0. 5 : 1的體積比加入至NaCI溶液中，混勻后 室溫15, OOOg離心5min，棄上清液；
[0026] 5)沉淀用適量CldH2O洗滌，室溫13, OOOg離心5min，棄上清液；
[0027] 6)用所提牛奶樣品1/50體積的CldH2O重選沉淀，獲得奶樣中微生物的濃縮液，作 為DNA模板。
[0028] (2) PCR法擴增檢測待檢樣本中的alpha-toxin基因，具體步驟如下：
[0029] 1)按照以下比例制備反應(yīng)體系：
[0030] ddH20 0. 5 μ L
[0031] 2 X Taq DNA MasterMix 12. 5 μ L
[0032] 上游引物（F1，F(xiàn)2 或 F3) (10μΜ) IuL
[0033] 對應(yīng)的下游引物（F1，F(xiàn)2或F3) (10μΜ) IyL
[0034] DNA 模板 IOyL
[0035] 2) PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如下：
[0036] 預(yù)變性：95°C 5min ;
[0037] 30 個循環(huán)：95°C 45s ;58°C 45s ;72°C Imin ;
[0038] 延伸：72°C 15min。
[0039] PCR反應(yīng)產(chǎn)物將用于電泳檢測鑒定，也可以保存于4°C。
[0040] (3)電泳檢測鑒定
[0041] 將步驟（2)PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，在凝膠成像儀中觀 察結(jié)果并拍照，如果檢測到期待大小的特異性條帶：如應(yīng)用第一對引物得到330bp條帶，應(yīng) 用第二對引物得到278bp條帶，或應(yīng)用第三對引物得到409bp條帶則證明所檢樣品中存在 致病性金葡菌。
[0042] 應(yīng)用本發(fā)明的從牛奶中快速提取并檢測致病性金葡菌的方法所制備的試劑盒，可 以快速準(zhǔn)確的檢測牛奶中是否存在致病性金葡菌，檢測方法簡便快速、特異性和靈敏度高。 整個檢測過程在同一天可以完成，與常規(guī)培養(yǎng)檢測法相比大大提高了檢測效率。
【附圖說明】
[0043] 圖1應(yīng)用3對alpha-toxin基因特異性引物PCR擴增DNA片段檢測結(jié)果，其中金 葡菌DNA模板采用按國標(biāo)法分離鑒定，來自內(nèi)蒙古奶樣中分離的高致病性金葡菌NM006的 菌液（濃度為lXl〇 3CFU/10yL) :l)Marker DL2000,2)是應(yīng)用第一對引物擴增金葡菌，3) 是應(yīng)用第二對引物擴增金葡菌，4)是應(yīng)用第三對引物擴增金葡菌，5)是應(yīng)用第一對引物擴 增ddH 20,6)是應(yīng)用第二對引物擴增ddH20,7)是應(yīng)用第三對引物擴增ddH20。
[0044] 圖2牛奶樣品檢測結(jié)果圖：標(biāo)準(zhǔn)金葡菌株1株以及按國標(biāo)法分離鑒定的19株金葡 菌株按IX IO4CFUA). 5mL人工污染無菌鮮牛奶利用第二對引物檢測的檢測結(jié)果，包括圖2-1 和圖2-2,其中：
[0045] 圖2-1 :l)Marker DL2000,2)是高致病性金葡菌基因組DNA，3)是陜西奶樣中分離 的金葡菌SX12003,4)是山東奶樣中分離的金葡菌SD009,5)是內(nèi)蒙古奶樣中分離的金葡菌 NM〇〇6,6)是內(nèi)蒙古奶樣中分離的金葡菌NM005,7)是黑龍江奶樣中分離的金葡菌HJ35,8) 是黑龍江奶樣中分離的金葡菌HJ31，9)是河北奶樣中分離的金葡菌HB31，10)是河北奶樣 中分離的金葡菌HB0823-2，11)是河北奶樣中分離的金葡菌HB49-3，12)是甘肅奶樣中分離 的金葡菌GS22，13)是甘肅奶樣中分離的金葡菌GS38，14)是購買的標(biāo)準(zhǔn)金葡菌ATCC29213， 15)是無菌鮮牛奶，16)是大腸桿菌基因組DNA，17)ddH 20。
[0046] 圖2-2 : DMarker DL2000, 2)是高致病性金葡菌基因組DNA，3)是浙江奶樣中分離 的金葡菌Zh_QS13,4)是浙江奶樣中分離的金葡菌Zh_JH006,5)是浙江奶樣中分離的金葡 菌Zh_HZ041，6)是重慶奶樣中分離的金葡菌CQ339,7)是新疆奶樣中分離的金葡菌XJ041， 8)是新疆奶樣中分離的金葡菌XJ048,9)是上海奶樣中分離的金葡菌SH008，10)是上海奶 樣中分離的金葡菌SH004，11)是無菌鮮牛奶，12)是大腸桿菌基因組DNA，13)ddH 20。
[0047] 圖3試劑盒特異性鑒定圖：按國標(biāo)法分離鑒定的7株非金葡菌和金葡菌分別 按I X I O4CFUzU 5mL人工污染無菌鮮牛奶利用第一對引物檢測的檢測結(jié)果，其中：1) MarkerDL2000,2)是高致病性金葡菌基因組DNA，3)是金黃色葡萄球菌NM006的對照，4) 是甘肅奶樣中分離的非金葡菌NSA_QZ55和金黃色葡萄球NM006菌混合，5)是甘肅奶樣中 分離的非金葡菌NSA_QZ55,6)是陜西奶樣中分離的非金葡菌NSA_5100152和金黃色葡萄 球NM006菌混合，7)是陜西奶樣中分離的非金葡菌NSA_5100152,8)是黑龍江奶樣中分離 的非金葡菌NSA_2K52和金黃色葡萄球NM006菌混合，9)是黑龍江奶樣中分離的非金葡菌 NSA_2K52，10)是黑龍江奶樣中分離的非金葡菌NSA_1K212和金黃色葡萄球NM006菌混合， 11)是黑龍江奶樣中分離的非金葡菌NSA_1K212，12)是北京奶樣中分離的非金葡菌NSA_ XY08001和金黃色葡萄球NM006菌混合，13)是北京奶樣中分離的非金葡菌NSA_XY08001， 14)是北京奶樣中分離的非金葡菌NSA_FM118和金黃色葡萄球NM006菌混合，15)是北京奶 樣中分離的非金葡菌NSA_FM118,16)是河北奶樣中分離的非金葡菌NSA_HB47和金黃色葡 萄球NM006菌混合，17)是河北奶樣中分離的非金葡菌NSA_HB47，18)是無菌鮮牛奶，19)是 大腸桿菌基因組DNA，20) ddH20。
[0048] 圖4試劑盒敏感度鑒定圖：按國標(biāo)法分離鑒定的1株金葡菌分別 按 I X 102CFU/0. 5mL，I X 103CFU/0. 5mL，I X 104CFU/0. 5mL，I X 105CFU/0. 5mL 和 I X 106CFU/0. 5mL濃度人工污染無菌鮮牛奶，利用第一對引物檢測的結(jié)果：1)是Marker DL2000,2)是高致病性金葡菌基因組DNA，3)是用