一組核苷酸序列及在嗜水氣單胞菌鑒定中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種DNA恒溫擴增技術(shù)，尤其涉及一種嗜水氣單胞菌的鑒定方法，屬 于微生物快速鑒定領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila)是一種革蘭陰性、能運動、兼性厭氧、氧化 酶陽性的桿狀細(xì)菌，屬于弧菌科、氣單胞菌屬。嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水 體，是多種水生動物的原發(fā)性致病菌，是典型的人-獸-魚共患病的病原菌。近年來大量研 宄表明，嗜水氣單胞菌可單獨或者與其他致病菌共同感染，引起人類腸胃炎、敗血癥以及外 傷引起軟組織感染等病癥，危害食品安全，并且是免疫缺陷病人和肝功能疾病患者的條件 致病菌，具有重要的公共衛(wèi)生意義。因此，為了給予臨床病人準(zhǔn)確快速的治療和嗜水氣單胞 菌的流行病學(xué)調(diào)查，研發(fā)一個省時、省力和特異性較高的嗜水氣單胞菌檢測方法成為必要。
[0003] 雖然嗜水氣單胞菌誘發(fā)腸胃炎的致病機理并未完全闡明，但研宄者已經(jīng)對一些潛 在的毒力因子進行了深入的研宄。攝取鐵離子與一些病原菌的毒力密切相關(guān)，人體中的亞 鐵血紅素是病原菌鐵離子的一個重要來源，并且許多病原菌本身就具有亞鐵血紅素運輸系 統(tǒng)，desA基因是編碼嗜水氣單胞菌亞鐵血紅素鐵離子利用系統(tǒng)的重要基因之一，并且編碼 一種外膜蛋白受體，可以從環(huán)境中攝取細(xì)菌生長和存活所必需的鐵離子，因此是一個理想 的檢測目的基因。
[0004] 目前對于嗜水氣單胞菌分離鑒定主要依賴于傳統(tǒng)的增菌培養(yǎng)和生化鑒定，該方法 耗時大約5天，包括增菌、選擇培養(yǎng)及后續(xù)的生化鑒定，耗時耗力。生化結(jié)果的判讀依賴于 人的主觀判斷，導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)差，易錯判。隨著核酸診斷技術(shù)的快速發(fā)展，一些以PCR為基 礎(chǔ)的診斷技術(shù)（如普通PCR技術(shù)，熒光PCR技術(shù)）被用于嗜水氣單胞菌的快速診斷，然而這 些方法依賴于昂貴的儀器設(shè)備，需要后續(xù)的電泳操作，較高的探針合成費用，以及熟練的操 作人員。一些基層實驗室無法開展，限制了這些技術(shù)的運用。此外PCR檢測技術(shù)的靈敏度 差，檢測過程耗時較長，不利于快速檢測和應(yīng)急檢測。隨著恒溫技術(shù)的出現(xiàn)，環(huán)介導(dǎo)恒溫擴 增技術(shù)（LAMP)已經(jīng)被用于很多病原菌的檢測，然而該技術(shù)的引物設(shè)計復(fù)雜，對目的基因的 序列長度要求較長且保守性要求較高。因而，急需發(fā)展一種簡單、快速、靈敏和特異的診斷 技術(shù)用于嗜水氣單胞菌檢測。
[0005] 交叉恒溫擴增技術(shù)（Cross priming amplification，CPA)是由 Xu Gaolian 等建 立的一種新的恒溫核酸擴增技術(shù)，具有靈敏高、操作簡單、不依賴于昂貴設(shè)備、產(chǎn)物易檢測 等優(yōu)點。該技術(shù)已被廣泛用于分子診斷領(lǐng)域。CPA先在靶序列上設(shè)定5個任意序列4a、la、 3s、2s和5s，設(shè)計與之互補的5條引物，5條引物之中交叉引物為1條，即As，該交叉引物自 5'末端依次含有2a和Is片段，即5' -2a-ls ;置換引物為2條，即4s和5a ;擴增引物為2 條，即3a和2a。利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，靶序 列能夠得以高效擴增。
[0006] CPA反應(yīng)僅需恒溫在62~66°C之間的一個溫度即可，該溫度是雙鏈DNA復(fù)性及延 伸的中間溫度，雙鏈DNA在該溫度范圍內(nèi)處于半解離和半結(jié)合的動態(tài)平衡狀態(tài)中，任何一 個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。CPA在 鏈置換Bst DNA聚合酶的作用下，以As引物Is區(qū)段的Y末端為起點，與對應(yīng)的模板DNA 序列互補配對，啟動鏈置換DNA合成。4s引物與模板片段4a互補結(jié)合，以3'末端為起點， 通過鏈置換活性DNA聚合酶的作用，首先置換出As引物合成的DNA鏈，同時合成自身DNA。 最終4s引物合成而得的DNA鏈與模板DNA形成雙鏈。然而由As引物先合成的DNA鏈被4s 引物進行鏈置換產(chǎn)生一單鏈，該單鏈通過模板5'末端的3s區(qū)段和引物3a互補，啟動DNA 合成；模板2s區(qū)段和引物2a互補，啟動鏈置換DNA合成，釋放含引物3a的DNA合成鏈，該合 成鏈能夠與引物2a和As互補結(jié)合，啟動第一個循環(huán)擴增。此外由引物2a互補合成的新鏈 能被下游的置換引物5a置換，產(chǎn)生的新鏈發(fā)生自我堿基配對，形成單一莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，啟動 第二個循環(huán)擴增。CPA反應(yīng)擴增的第一個循環(huán)階段：形成的短鏈產(chǎn)物處于解鏈與結(jié)合動態(tài) 平衡，引物能夠與解離的單鏈結(jié)合實現(xiàn)擴增循環(huán)；第二個循環(huán)階段：在啞鈴狀結(jié)構(gòu)中，As引 物中的Is與環(huán)上單鏈Ia雜交，啟動新一輪鏈置換反應(yīng)，擴增出短鏈DNA，形成的短鏈產(chǎn)物同 樣處于解鏈與結(jié)合動態(tài)平衡，引物能夠與解離的單鏈結(jié)合實現(xiàn)擴增，并產(chǎn)生新的莖環(huán)結(jié)構(gòu)， 從而實現(xiàn)CPA的循環(huán)擴增。CPA反應(yīng)可以特異、高效、快速的擴增目的DNA，在1小時之內(nèi)使 產(chǎn)物的量達到IO9個拷貝。
[0007] CPA擴增之后，其產(chǎn)物的檢測可以通過瓊脂糖電泳后染色觀察。較為簡便的方法是 直接在反應(yīng)體系中加入Loopamp熒光染料，呈現(xiàn)綠色為陽性反應(yīng)，橙紅色為陰性反應(yīng)。也可 以通過擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度進行判斷，液體渾濁，離心或有白色沉淀的為陽性 反應(yīng)，無此現(xiàn)象的則為陰性反應(yīng)。
[0008] 本發(fā)明的目的就是通過特異的引物設(shè)計，建立一種用于非診斷目的的嗜水氣單胞 菌的方便、快速、特異、靈敏的CPA檢測方法，以能夠在基層實驗室進行大規(guī)模的推廣使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 基于上述目的，本發(fā)明首先提供了一組用于交叉恒溫擴增技術(shù)的核苷酸序列，所 述序列包括：含有如SEQ ID NO :6所示序列的核苷酸序列作為交叉引物，含有如SEQ ID NO: 3所示序列的核苷酸序列和含有如SEQ ID NO :4所示序列的核苷酸序列作為擴增引物，含 有如SEQ ID NO: 1所示序列的核苷酸序列和含有如SEQ ID NO :5所示序列的核苷酸序列作 為置換引物。
[0010] SEQ ID N0:l、3、4、5和6是根據(jù)嗜水氣單胞菌desA基因作為模板基因設(shè)計出來 的。本發(fā)明的發(fā)明點在于上述5種序列能夠與嗜水氣單胞菌desA基因的特定區(qū)段進行特 異性的結(jié)合。含有上述針對desA基因具有特異性的5種序列的引物，例如對SEQ ID NO: 1、3、4、5和6的5'端和/或3'端的添加性修飾都能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的，因此也都在本 發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0011] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述序列包括：如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列作為 交叉引物，如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列作為擴 增引物，如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列作為置換 引物。
[0012] 其次，本發(fā)明還提供了應(yīng)用上述序列組合進行交叉恒溫擴增的方法，所述方法包 括如下步驟：
[0013] (1)將待檢測樣本、上述的5種序列作為引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、MgSO4、甜菜 堿以及交叉恒溫擴增緩沖液加入到反應(yīng)容器中；
[0014] (2)將步驟⑴所得的混合液放置于62~66°C之間的溫度環(huán)境中進行DNA擴增 反應(yīng)；
[0015] (3)檢測步驟⑵獲得的產(chǎn)物。
[0016] 優(yōu)選地，步驟（1)中所述待檢測樣本為DNA提取物，待檢測樣本的來源可以為細(xì)菌 培養(yǎng)物、體液或人體分泌物樣本。
[0017] 優(yōu)選地，在步驟（1)的反應(yīng)容器中的所述置換引物的濃度為0.3mM，所述交叉引物 的濃度為2. 4mM，所述擴增引物的濃度為I. 44mM。
[0018] 優(yōu)選地，步驟（2)中所述的溫度環(huán)境為65°C。
[0019] 優(yōu)選地，步驟⑵中所述的DNA擴增反應(yīng)時間為1小時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù) 實際檢測進度的需要對反應(yīng)時間進行適當(dāng)?shù)卣{(diào)整，而不會影響實際的反應(yīng)效率。
[0020] 優(yōu)選地，步驟（3)所述的檢測方法為電泳檢測法、濁度檢測法、或染色檢測法。
[0021] 電泳檢測法：擴增產(chǎn)物是一系列不同大小的DNA片段混合物，陽性產(chǎn)物為電泳后 在凝膠上顯現(xiàn)不同大小區(qū)帶組成的階梯式圖譜，而陰性反應(yīng)不出現(xiàn)條帶。
[0022] 濁度檢測法：CPA在合成DNA的同時還產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，它們能與鎂離子 結(jié)合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，可根據(jù)反應(yīng)體系中是否形成白色沉淀來定性判斷CPA反應(yīng) 是否發(fā)生。
[0023] 染色檢測法：在反應(yīng)體系中加入的Loopamp焚光染料是一種媽黃綠素螯合劑，在 反應(yīng)起始，體系中的錳離子將鈣黃綠素螯合，不發(fā)射熒光；反應(yīng)結(jié)束后生成Mn2P2O7，釋放出 鈣黃綠素而發(fā)射熒光。呈現(xiàn)綠色為陽性反應(yīng)，橙紅色為陰性反應(yīng)。
[0024] 更為優(yōu)選地，所述染色檢測使用的染料為Loopamp熒光染料FD。
[0025] 第三，本發(fā)明還提供了一種用于檢測嗜水氣單胞菌的試劑盒，所述試劑盒包括上 述的5種序列作為引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、甜菜堿、MgSO4、以及恒溫擴增緩沖液。本發(fā) 明提供的試劑盒可以應(yīng)用常規(guī)的交叉恒溫擴增技術(shù)的試劑和反應(yīng)常數(shù)技術(shù)擴增。
[0026] 發(fā)明人建立了 CPA技術(shù)對嗜水氣單胞菌的檢測方法。通過對CPA檢測和qPCR檢 測進行比較，我們發(fā)現(xiàn)CPA檢測無論在檢測靈敏度上還是在對樣本的檢測能力上都與qPCR 相一致。但是qPCR技術(shù)的檢測成本較高，需要精密昂貴的熱循環(huán)儀器，且對實驗環(huán)境和操 作者的技術(shù)也有嚴(yán)格的要求，因此限制了該技術(shù)的普遍適用性，不利于在農(nóng)村地區(qū)以及基 層實驗室的推廣應(yīng)用。而CPA技術(shù)設(shè)備簡單，易操作，其反應(yīng)只需要一個普通的水浴鍋或者 恒溫裝置，不需要昂貴的PCR儀，易于在基層實驗室和農(nóng)村地區(qū)推廣應(yīng)用。一般情況下，以 分子水平為基礎(chǔ)的檢測方法例如PCR和qPCR都會受臨床標(biāo)本中抑制物的影響，一些研宄者 報導(dǎo)CPA使用的Bst聚合酶對樣品中抑制物的耐受能力比qPCR中的Taq酶要強，因此CPA 技術(shù)具有更廣闊的臨床應(yīng)用前景。
[0027] 總之，本研宄建立的CPA方法是首次將CPA技術(shù)運用到了嗜水氣單胞菌的檢測，該 方法在Ih內(nèi)就可以觀察結(jié)果，滿足了臨床快速診斷的需要。在以常見的致病菌及條件致病 菌DNA為模板評價CPA反應(yīng)體系的特異性的實驗中，該體系在檢測33種其他常見致病菌和 機會致病菌時未出現(xiàn)特異性擴增，說明該檢測體系的特異性良好。CPA方法擴增反應(yīng)條件簡 單，溫度單一、反應(yīng)及結(jié)果研判快速，所需儀器設(shè)備簡單，可作為一種快速的篩查方法在臨 床檢驗檢疫、基層實驗室及農(nóng)村地區(qū)進行大規(guī)模的推廣使用。
【附圖說明】
[0028] 圖I. CPA檢測desA基因的引物設(shè)計位置和方向不意圖；
[0029] 圖2. CPA對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測的靈敏度評價濁度分析圖；
[0030] 圖3. CPA對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測的靈敏度評價電泳分析圖；
[0031] 圖4. CPA對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測的靈敏度評價焚光目測圖；
[0032] 圖5. CPA對模擬標(biāo)本檢測的靈敏度評價濁度分析圖。
【具體實施方式】
[0033] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的保護范圍構(gòu)成任何限制。
[0034] 本發(fā)明實施例所用標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國藥品生物制品檢定所，其他菌株分離自食 品、糞便和嘔吐物等樣品，均經(jīng)德靈WALKAWAY-40SI全自動微生物分析儀鑒定。用于特異性 評價的菌株見表2。
[0035] 序列設(shè)計
[0036] 根據(jù)嗜水氣單胞菌特異性基因 desA設(shè)計交叉反應(yīng)引物。desA基因編碼一種外膜 蛋白受體，可以從環(huán)境中攝取細(xì)菌生長和存活所必需的鐵元素。我們利用多序列比對軟件 ClustalX 1. 83對嗜水氣單胞菌的參考菌株進行desA基因的序列比對，在該基因的保守區(qū) 域使用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0設(shè)計交叉反應(yīng)引物，并將設(shè)計的引物在NCBI數(shù) 據(jù)庫中進行序列比對分析，以排除引物與其他物種序列可能