一種長(zhǎng)鏈非編碼rna mrak053938在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA-MRAK053938基因序列 在預(yù)防和治療特發(fā)性肺纖維化中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 長(zhǎng)鏈非編碼 RNA (long noncoding RNA，IncRNA)是由 Okazaki 等在 2002 年對(duì)小鼠 全長(zhǎng)互補(bǔ)DNA(cDNA)文庫(kù)測(cè)序時(shí)首次發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)度超過(guò)200nt的RNA分子，占哺乳動(dòng)物 基因組序列4 %~9 %，它們?nèi)狈Φ鞍拙幋a功能，位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，具有明顯的細(xì)胞、 組織特異性和發(fā)育階段特異性。IncRNA作為一類新的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其強(qiáng)大 的調(diào)控作用及復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制引起了研究者的廣泛關(guān)注。隨著IncRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，研究人 員越來(lái)越關(guān)注其在各種生物學(xué)過(guò)程以及疾病中的表達(dá)變化及調(diào)控機(jī)制。研究表明，IncRNA 的異常表達(dá)與人類多種疾病相關(guān),如白血病、冠心病、糖尿病、阿爾茨海默病、自閉癥、非小 細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC)、肝癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、肺纖維 化等，是重要的藥物作用及分子治療靶標(biāo)。
[0003] 肺纖維化臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難并伴有刺激性干咳，肺功能為限制性通氣障 礙，病情一般持續(xù)惡化，最終因呼吸衰竭而死亡。近年來(lái)，由于環(huán)境污染導(dǎo)致的霧霾，使肺 纖維化的發(fā)病率逐年上升，一旦確診為肺纖維化，患者大多生存時(shí)間只有3至5年，病死率 高，五年生存率僅為23%，其治療仍屬世界性難題。傳統(tǒng)的治療以皮質(zhì)激素類藥物為主，臨 床研究結(jié)果顯示這些藥物不能有效抑制肺纖維化的發(fā)生，反而可加重某些重癥患者肺纖維 化程度，亟需尋找新的、有效的治療肺纖維化的方法。本發(fā)明應(yīng)用RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn) MRAK053938能夠抑制肺肌成纖維細(xì)胞的活化和遷移，是潛在的治療肺纖維化疾病的分子和 藥物靶點(diǎn)，具有很好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA-MRAK053938)基因的應(yīng)用方 法，具體為該基因在預(yù)防和治療肺纖維化中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所涉及的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA-MRAK053938)基因序列如下所示（SEQ ID NO ：1)：
[0006] TTAAATTATTTCATGTAATTTATCCTCTGAAGAAGACAGTGTCTAGTTAGAAACACGAGGATCTTCATA TTGCATTCATTGCCCTTAAATGGCTCTCTTCTCTTCAAAGAAATGGTGGAAGGATGACATCAATTTTACAAGTTCAG GAGTGGACCCCAAAATTCTAGAAATGGTTTAAATCAAAATTACAAATATTCACTCAATGATACAAACAAAATGTTTA TTTTTGGTGAAATTTTGCTCTGTATGAAATTCACATTGAATTATGAAAATGTACA ATATTCGGGGTTCTCTTGCAT ATTTACAGTTTTTTCTACTTATACACATAGTTGAATCAACCATTATTTAGAGCTAAAAAAATACCTTTTCCCTAAAT GTGAATTATTCGTAAAATCCAAAATAACATAGCAAAATCATTTCGTTTTAAGATGAAATTTTTACTTGCAAATTTTA TATTAATAATGCAAATATTTTAGAATCATGGCTTGGACTTTATCAGTCAAGTCTCCAAATGTAAAGAAAACACACCT CCACTGTGTTACTTAAAAACTAAATACTGAGAAGTATTTGAAGGACTGGTGCTGGTTTTATAATAATAATAAGGTTC TCGGAATTTAACGTATTTATAAAATTGTTGCCTCTATCCTGAGATTAGGGGACCCAGCCATACTGGTTTTATATCTA TTACTGAGCTGGTAATCAATGTCAGTTTTGTAAAATGAGGGAAATATTTTTCTATATTTTCTATCTCTCCAAATACA TTTTAAACCAGAAAAAATAATAATCCAATTTCTGATGAGGTGTTTGGTGACTTCCAAACAGTAAGAGTCACTGACAT TTCCATCATGCTACAATGGCTTTTATCTTTTCTTACTATAGGACTCAGCCTTCTATAAAGATCTGGACAATTCCTAT TAGAGAAACCACTGAGTAATATTTTAAAACTGTAACAAATAAATAGAATCTATCCTGAACTCTCAGGCCACACCTTT AATCACAGCTGTGTGTGGTTTGCCCGAATGTGCTTCCCTGGAATTAGTTTCAGTTCCTTATGGCCCTTTCATTAAGC CTCTCTAGTTTTTATCTTTTCTATAAGTGGAATCTATTCTAAAAGTATGTGTTACTTTCTTATATTTTCAT
[0007] AAGAAAAAGTGTTGAAGTATCTTTACCATTTAAGTGTTCTCAGAATAGAGTTTAGACATTGGAGAAATG TTTTCCATGAAGATCAAAATGTACTATGTCCTGAATATTGGACAACATGAAAATATGTTGTAGGTCACCATGTTCTG GGGTTGTTACAGACTATGGAAGAAAGCTGTAGAATATGCCTCGTAACCTAAACTCTATTCAGTTCTTTTTCTTGGAA AACAAAAAAGATTAATTTTATTTGC
[0008] 本發(fā)明設(shè)計(jì)出一個(gè)針對(duì)該lncRNA-MRAK053938基因的干擾序列，其是由SEQ ID NO :2所示的第一鏈和與其互補(bǔ)的SEQ ID NO :3所示的第二鏈通過(guò)堿基配對(duì)組成的RNA雙 鏈分子第一鏈和第二鏈各自在3'末端設(shè)計(jì)有兩個(gè)突出的堿基dT ;該干擾雙鏈RNA分子結(jié) 構(gòu)如下：
[0009]
[0010] 本發(fā)明的目的通過(guò)下列步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)：通過(guò)設(shè)計(jì)上述特異性的針對(duì) lncRNA-MRAK053938的干擾序列，將其轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，起到下調(diào)lncRNA-MRAK053938表達(dá)的 作用，從而實(shí)現(xiàn)防治肺纖維化的目的。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1是MRAK053938的表達(dá)變化圖：
[0012] A為lncRNA-MRAK053938在正常大鼠肺組織和博萊霉素誘發(fā)的大鼠肺纖維化組織 中的表達(dá)變化；B為lncRNA-MRAK053938在TGFP 1誘導(dǎo)激活的RLE-6TN細(xì)胞中的表達(dá)變化； C為lncRNA-MRAK053938在TGFP 1誘導(dǎo)激活的RLl細(xì)胞中的表達(dá)變化。
[0013] 圖2是MRAK053938的siRNA干擾片段對(duì)肌成纖維細(xì)胞激活相關(guān)蛋白a -SMA表達(dá) 的影響圖：
[0014] A為a-SMA在給與不同處理RLE-6TN細(xì)胞中的表達(dá)變化；B為a-SMA在給與不同 處理細(xì)胞RLl中的表達(dá)變化。
[0015] 圖3是MRAK053938的siRNA干擾片段對(duì)肌成纖維細(xì)胞遷移能力的結(jié)果圖。
[0016] 圖4是miR-708-3P的表達(dá)變化圖：
[0017] A為miR-708_3P在正常大鼠肺組織和博萊霉素誘發(fā)的大鼠肺纖維化組織中的表 達(dá)變化；B為miR-708-3P在給與不同處理RLE-6TN和RLl細(xì)胞中的變化圖。
[0018] 圖5是Vimentin的表達(dá)變化圖：
[0019] A為Vimentin在正常大鼠肺組織和博萊霉素誘發(fā)的大鼠肺纖維化組織中的表達(dá) 變化；B為Vimentin在給與不同處理RLE-6TN細(xì)胞中的表達(dá)變化；C為Vimentin在給與不 同處理細(xì)胞RLl中的表達(dá)變化。 具體實(shí)施例
[0020] 下面的實(shí)例用以解釋本發(fā)明，但是并非對(duì)本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容的限制。
[0021] 實(shí)施例1. lncRNA-MRAK053938在正常肺組織與纖維化組織中的表達(dá)情況
[0022] - .材料SD大鼠，雄性，體重200±20克，清潔級(jí)，由山東綠葉制藥股份有限公司 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SYXK (魯）20030020,在清潔級(jí)動(dòng)物觀察室，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天； 正常肺上皮細(xì)胞株（RLE-6TN)、成纖維細(xì)胞株（RLl)購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)；RPMI1640培養(yǎng)基、高 糖 DMEM 培養(yǎng)基（DMEM-LG)、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公 司；TGF-β 1購(gòu)自invitrogen公司；riboFECT? CP轉(zhuǎn)染試劑（銳博生物科技有限公司，廣 州，中國(guó)）；SYBR Green PCR Master Mix(TAKARA，大連，中國(guó)）。
[0023] 二·方法
[0024] 1.制備大鼠肺纖維化模型：30只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組，大鼠用4%水 合氯醛（lml/lOOg體重）腹腔麻醉，麻醉后將其仰臥固定，用碘氟消毒皮膚，無(wú)菌操作下切 開長(zhǎng)約Icm的頸中切口，逐層分離暴露氣管（如室溫低，注意保溫），模型組大鼠氣管內(nèi)一 次性注入博萊霉素溶液（5mg/kg)，正常組大鼠注入等體積無(wú)菌生理鹽水；注射完畢縫合皮 膚，手術(shù)部位用碘氟或青霉素消毒預(yù)防感染，室溫保持在24°C~25°C待蘇醒，動(dòng)物自然清 醒后常規(guī)飼養(yǎng)。
[0025] 2.細(xì)胞培養(yǎng)及分組：RLE-6TN細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMl 1640培養(yǎng)液，RLl細(xì) 胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37°C、5% C02飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。選取處于 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，接種于六孔培養(yǎng)板。設(shè)空白對(duì)照組、TGF-β 1刺激 組，待細(xì)胞生長(zhǎng)