利用SPR基因dsRNA抑制斜紋夜蛾生長發(fā)育和生殖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用SPR基因 dsRNA抑制斜紋夜蛾生長發(fā)育和生殖的方法，屬昆 蟲生理和植物害蟲防治技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 斜紋夜蛾 (Fabricius) (Lepidoptera :Noctuidae)，是我國 糧、棉、煙草、蔬菜等作物的重要害蟲，且具有很強(qiáng)的耐藥性。對(duì)于該種的防治目前主要還是 采用化學(xué)防治，由于該蟲的適應(yīng)性及耐藥性極強(qiáng)，在防治該蟲時(shí)化學(xué)農(nóng)藥用量越來越高，給 食品安全及環(huán)境污染問題帶來嚴(yán)峻考驗(yàn)。探索綠色防治該害蟲的新技術(shù)新手段已成為當(dāng)前 必須重視的問題。
[0003] 近年來興起的RNA干擾（RNAi)技術(shù)除了在基因功能研宄上取得了驕人的成績， 同時(shí)也在病蟲害防治上顯示出了巨大的潛力。選擇合適的靶基因和適當(dāng)?shù)膶?dǎo)入方法是RNAi 技術(shù)成功應(yīng)用于害蟲防治的關(guān)鍵。與害蟲生存(如生長發(fā)育）與生殖(如交配產(chǎn)卵）等有關(guān) 的關(guān)鍵基因是RNAi的理想靶基因。基于注射dsRNA的RNAi技術(shù)常用于基因功能研宄，在 害蟲防治研宄和實(shí)踐中，害蟲通過取食dsRNA (人為噴施、菌體或轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生）是較為 可行的導(dǎo)入手段，其關(guān)鍵點(diǎn)是要明確害蟲是否可通過取食dsRNA而導(dǎo)致靶基因沉默并影響 其生存和生殖。
[0004] Yapici等（2008)最先從果幡Λ 獲得一個(gè)性肽受體（sex peptide receptor, SPR)，交配過的SPR基因缺失的雌幡與野生處女雌幡一樣只產(chǎn)少量卵 且容易對(duì)雄性求愛產(chǎn)生應(yīng)答，而交配過的野生雌蠅卻不容易接受雄性的求愛及產(chǎn)卵數(shù)量開 始成倍增加。隨后SPR基因也在棉鈴蟲/fe/icoFerjDa arffiigera (Hanin et al. 2012)及 斜紋夜蛾5： /itora (Li et al. 2014)中被發(fā)現(xiàn)，注射RNAi表明該基因在這兩種蛾類中 同樣調(diào)控雌性的生殖，并可能影響性信息素的合成與釋放。另有研宄還發(fā)現(xiàn)，SPR也可能是 幼蟲蛻皮和生長發(fā)育調(diào)節(jié)的重要基因 （Yamanaka et al. 2010)，因此，如果在幼蟲中沉默 SPR基因，有可能導(dǎo)致其生長發(fā)育受到抑制，進(jìn)而死亡。上述這些研宄中SPR的RNAi只在 成蟲中做過，沒有在幼蟲中開展過，采用的是體內(nèi)表達(dá)和注射dsRNA法，并沒有采用過取食 dsRNA法。因此，本發(fā)明通過斜紋夜蛾幼蟲和成蟲取食SPR基因的dsRNA，導(dǎo)致SPR基因表 達(dá)沉默，從而致使斜紋夜蛾幼蟲生長發(fā)育受到抑制，進(jìn)而死亡，也能夠?qū)е麓菩猿上x交配后 不產(chǎn)卵或只產(chǎn)少量卵。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見與本發(fā)明相同的公開報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，而提供一種利用SPR基因 dsRNA抑制斜 紋夜蛾生長發(fā)育和生殖的方法。
[0006] 本發(fā)明通過斜紋夜蛾幼蟲和成蟲取食SPR基因的dsRNA，導(dǎo)致SPR基因表達(dá)沉默， 從而致使斜紋夜蛾幼蟲生長發(fā)育受到抑制，進(jìn)而死亡，也能夠?qū)е麓菩猿上x交配后不產(chǎn)卵 或只產(chǎn)少量卵。進(jìn)而抑制斜紋夜蛾生長發(fā)育和生殖，也為綠色防治該害蟲提供新思路和技 術(shù)。
[0007] 本發(fā)明的利用SPR基因 dsRNA抑制斜紋夜蛾生長發(fā)育和生殖的方法，其具體步驟 如下： (1 )、SPR基因 RNAi目標(biāo)片段選擇及dsRNA制備 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中登陸號(hào)為JX070670的斜紋夜蛾SPR基因的cDNA序列，通過 siDirect version 2. 0軟件進(jìn)行分析，找到一段最優(yōu)RNAi目標(biāo)片段，即JX070670的cDNA 序列的1564 -1792堿基，長229bp，具體序列為： 5' -TAATTTCAAGCACTATAGTCGAAATTTTAGATTACTATATAGCAAACATTTTGATTCTTATAACCAAT TTCTTTATCTTGGTCTCTTATCCTATTAATTTTGCTATTTACTGTGGTATGTCGAGGCAGTTTAGGGAGACGTTTA AAGAACTGTTCATTCGAGGAGCTGTTACTAGCCGTAAGAATGGCGGCTCTAGTAGATACTCCCTGGTCAACGGTCCA AGGACATG-3' 再根據(jù)這段長229bp的序列設(shè)計(jì)dsRNA制備引物一對(duì):ιΗ向引物5' -TAATACGACTCACTA TAGGGCATAATTTCAAGCACTATAGTC-3 '反向引物 5 ' -TAATACGACTCACTATAGGGCATGTCCTTGGACCG TTGAC-3'，其中下劃線部分序列為T7啟動(dòng)子； 用這段引物，以斜紋夜蛾總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，通過PCR獲得目標(biāo)基因片 段，再以這一片段為模板采用試劑盒合成dsRNA ; (2)、用SPR基因 dsRNA抑制斜紋夜蛾生長發(fā)育和生殖 a，斜紋夜蛾的人工飼養(yǎng) 斜紋夜蛾幼蟲采用人工飼料在24~27°C，60~80%RH，光照：黑暗=14:10的條件下 飼養(yǎng)；在蛹期將雌雄分開單獨(dú)關(guān)養(yǎng)，羽化的成蟲用10%蔗糖水喂養(yǎng)；在上述條件下幼蟲期為 15天，蛹期11天，成蟲期12天；人工飼料為：玉米粉100g，黃豆粉100g，胡蘿卜粉50g，酵 母粉3(^，干酪素2(^，蔗糖2(^，瓊脂粉2(^，水100〇1111，100°0蒸111; b. dsRNA 喂食 將dsRNA拌入人工飼料中，從0日齡幼蟲開始，每天喂食一次，即：0-2日齡每天每只喂 O.lyg dsRNA, 3-6日齡每天每只喂0.5yg dsRNA, 7-15日齡每天每只喂2yg dsRNA;給 0-3日齡的成蟲每天每只喂食約2 yg dsRNA，即將dsRNA加入到10%蔗糖水中以供取食； 以喂食不添加 dsRNA的飼料和糖水的幼蟲和成蟲為對(duì)照，通過各期生長發(fā)育、致死率、及產(chǎn) 卵分析抑制生長發(fā)育和生殖。
[0008] c. dsRNA喂食抑制生長發(fā)育和生殖分析 通過各期生長發(fā)育、致死率、及產(chǎn)卵分析，結(jié)果表明喂食dsRNA的幼蟲生長緩慢，幼蟲 期達(dá)20天以上，幼蟲期死亡率在40%以上，蛹期在15天以上，羽化率不足50%，雌蟲交配后 產(chǎn)卵量只有400個(gè)。而喂食不添加 dsRNA的飼料和糖水的斜紋夜蛾，幼蟲期約為15天，幼 蟲期死亡率在10%以下，蛹期11天，羽化率在80%以上，成蟲期12天，交配后雌蟲產(chǎn)卵量平 均在1000個(gè)以上。
[0009] 本發(fā)明通過人工合成上述dsRNA進(jìn)行田間噴施，或通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將該目標(biāo)片段 的dsRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到菌體或植物中產(chǎn)生相應(yīng)的dsRNA，斜紋夜蛾通過感染菌體或取食 植物組織或花蜜，間接獲得SPR基因的dsRNA，引起SPR基因表達(dá)沉默，進(jìn)而抑制斜紋夜蛾 生長發(fā)育和生殖，從而達(dá)到防治該害蟲的目的。
[0010] 本發(fā)明的有益效果在于：利用取食SPR基因 dsRNA的基因沉默技術(shù)來防治農(nóng)業(yè)重 要害蟲斜紋夜蛾，能夠顯著抑制斜紋夜蛾的生長發(fā)育和生殖，為綠色防治該害蟲提供了一 個(gè)新的思路和技術(shù)。
[0011]
【具體實(shí)施方式】： 本實(shí)施例的利用SPR基因 dsRNA抑制斜紋夜蛾生長發(fā)育和生殖的方法同
【發(fā)明內(nèi)容】
部分 所述。
[0012] 下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的描述，具體步驟如下： (一) 、人工飼料配制所用原料來源：
(二) 、飼料配制 取玉米粉100g，黃豆粉100g，胡蘿卜粉50g，酵母粉30g，干酪素20g，蔗糖20g，瓊脂 粉20g，水1000ml，混勻，置于蒸鍋內(nèi)蒸lh。