Gdf15受體下游信號因子的鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程和分子生物學領域。更具體而言，本發(fā)明涉及⑶F15受體下 游信號因子的鑒定及應用。
【背景技術】
[0002] 生長分化因子15 (⑶F15)是轉化生長因子β (TGF- β )超家族的一員，具有典型的 TGF-β超家族蛋白結構特點。GDF15在胚胎的生長發(fā)育，細胞對壓力信號的反應，炎癥和組 織損傷后修復的過程中均起著重要作用。TGF-β是一個多功能細胞因子，可以影響多種細 胞的生長、分化及凋亡。在免疫系統(tǒng)中，TGF-β能夠誘導Foxp3在⑶4+⑶25-Τ細胞中的表 達，使前〗、6 1'細胞分化為丨!^68。〇^15基因的661^&1^登錄號為：匪_004864.2，蛋白的 GenBank 登錄號為：NP_004855. 2。
[0003] GDF15在靜態(tài)細胞中的表達量往往比較低，但是許多細胞壓力信號都可以使 GDF15的表達量突然提高，例如在炎癥、病毒感染、急性組織損傷等情況下或在腫瘤惡化過 程中。許多信號通路都與GDF15的表達、分泌及其在細胞基質中的儲存的調節(jié)有關，并調節(jié) ⑶F15的功能。⑶F15的表達受P53、Spl、Sp3、Nkx-2、NF-κ B、AP-I等多個轉錄因子的調 控，P53對GDF15的調控作用與其在抑制腫瘤轉移和促進凋亡方面密切相關。GDF15的啟動 子區(qū)具有兩個P53的結合位點，其啟動子激活具有顯著的P53濃度依賴性和P53轉錄結合 位點依賴性。在人卵巢癌和前列腺癌細胞中，GDF15作為P53的下游因子被誘導表達，可以 降低癌細胞的轉移。此外，許多其它轉錄因子也能誘導GDF15在一定類型的細胞中表達，例 如在乳腺癌細胞中，Akt的激活能夠上調GDF15的表達。在黑色素細胞中，紫外線照射能夠 明顯上調⑶F-15的mRNA水平，而在黑色素瘤細胞系中，通過激活MAPK和MITF也能夠明顯 上調0^-15的1^隱水平。
[0004] ⑶F15通過自分泌和旁分泌的作用發(fā)揮抗炎癥反應、抑制生長、促進腫瘤細胞凋亡 等功能。作為TGF-β超家族的一員，GDF15可通過依賴或非依賴Smad的方式傳導信號，也 可通過激活其它的信號元件來發(fā)揮功能，如PI3K/Akt、FAK-RhoA、Ras/MAPKs等。雖然⑶F15 的受體還沒有被鑒定出來，但是作為TGF-β超家族的一員，在某些細胞中GDF15能夠通過 激活TGF-β的I型和II型受體及細胞內的Smad蛋白復合物來介導細胞的反應。Yi Sun 等證明GDF15蛋白或轉染的GDF15能夠抑制前列腺癌細胞系的生長，該過程的信號通路與 TGF-β的相似，⑶F15能夠對存在完整TGF-β信號通路的癌細胞系的生長起到抑制作用， 但是不能對TGF- β I型和II型受體突變細胞或SmacM失活細胞起到抑制作用。GDF15在培 養(yǎng)的新生兒心肌細胞中的表達能夠通過激活Smad2/3的信號通路起到誘導抗心肌肥厚反 應，通過過表達Smad6/7可以消除⑶F15的此種作用。在肝癌細胞中，⑶F15通過Akt及其 下游信號通路的磷酸化來介導其功能。SK Batra等證明在前列腺癌細胞中，⑶F15能夠通 過激活FAK-RhoA信號通路，介導肌動蛋白的調整，從而影響癌細胞的遷移。在乳腺癌細胞 中，目前已知⑶F15能夠激活ErbB家族受體酪氨酸激酶，并能夠通過反式激活ErbB2而激 活Erkl/2和Akt，從而激活乳腺癌細胞的侵襲潛能。
[0005] 綜上所述，GDF15在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮著重要的作用，在癌癥發(fā)生發(fā)展 的不同階段均發(fā)揮著重要的作用，但由于其精確受體目前尚未鑒定，所以在分子機制上研 究GDF15如何發(fā)揮其多樣性功能至關重要，這將為基礎分子免疫研究轉化為臨床研究，以 及多種癌癥如乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多種癌癥的治療提供新的藥物靶點。此外，Treg細 胞在癌癥的發(fā)生發(fā)展及逃逸過程中均發(fā)揮著重要的功能，而TGF- β對調節(jié)性T細胞的分化 及功能發(fā)揮有著重要的作用。
[0006] 因此，了解作為TGF-β家族的⑶F15蛋白對調節(jié)性T細胞作用將有利于進一步研 究GDF15在不同的癌癥發(fā)展過程通過調節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮的功能。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供⑶F15受體下游信號因子的鑒定及應用。
[0008] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種制備生長分化因子15(⑶F15)胞外區(qū)的方法，所 述方法包括：
[0009] (1)提供一表達構建物，其從5'至3'端依次包括以下操作性連接的元件：His標 簽序列，F(xiàn)LAG標簽序列，TEV蛋白酶體識別序列，鈣調素結合蛋白（CBP)的基因序列，生長分 化因子15胞外區(qū)序列；
[0010] ⑵將步驟（1)的表達構建物與HSP90蛋白的表達構建物共轉大腸桿菌（如 Rosetta)細胞，表達獲得帶有TAP標簽的生長分化因子15胞外區(qū)（較佳地，包括二聚體形 式的結構）。
[0011] 在一個優(yōu)選例中，步驟（2)之后，還包括分離純化所述帶有TAP標簽的生長分化因 子15胞外區(qū)的步驟。
[0012] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達構建物，其從5'至3'端依次包括以下操作性 連接的元件：His標簽序列，F(xiàn)LAG標簽序列，TEV蛋白酶體識別序列、鈣調素結合蛋白（CBP) 的基因序列，生長分化因子15胞外區(qū)序列。
[0013] 在一個優(yōu)選例中，所述的表達構建物是表達載體。
[0014] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的表達構建物的用途，用于表達帶有TAP標簽的 生長分化因子15胞外區(qū)，捕獲與生長分化因子15相互作用的蛋白。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種捕獲與生長分化因子15相互作用的蛋白的方法， 所述方法包括：
[0016] (a)利用所述的表達構建物表達獲得帶有TAP標簽的生長分化因子15胞外區(qū)；
[0017] (b)利用His標簽，鎳柱純化獲得純化中間物1 ;
[0018] (c)利用Flag抗體，對步驟（b)的產(chǎn)物進一步純化（如用Protein A/G beads純 化），獲得純化中間物2 ;
[0019] (d)利用TEV酶酶切純化中間物2,獲得純化中間產(chǎn)物3 ;
[0020] (e)利用鈣調素從中間產(chǎn)物3中捕捉獲得終產(chǎn)物，該終產(chǎn)物包括與生長分化因子 15相互作用的蛋白。
[0021] 在一個優(yōu)選例中，步驟（c)中，以附著有抗Flag抗體的Protein A/G的固相載體 (較佳地為珠（beads))與Flag結合，進行純化。
[0022] 在一個優(yōu)選例中，步驟（e)中，以附著有鈣調素的固相載體（較佳地為珠（beads)) 與鈣調素結合蛋白結合，進行捕捉。
[0023] 在一個優(yōu)選例中，步驟（e)后，還包括：
[0024] 步驟（f):將捕捉出的復合物質譜鑒定，分析出與生長分化因子15相互作用的蛋 白；和/或
[0025] 步驟（g):通過抑制劑實驗和/或基因沉默（knock down)實驗確定與生長分化因 子15相互作用的蛋白對于生長分化因子15信號通路的影響。
[0026] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種蛋白復合物，所述的復合物包括：生長分化因子 15胞外區(qū)以及與之結合的下游蛋白，所述的下游蛋白包括：GNAI1，GNB1，MMl，CAMKII， MERTK0
[0027] 在本發(fā)明的另一方面，提供生長分化因子15(⑶F15)胞外區(qū)的用途，用于體外誘 導naive T細胞分化表達Foxp3為iTreg細胞。
[0028] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0029] 圖1A-1C、體外純化出帶有親和純化標簽的有活性的TAP-tag-ex⑶F15蛋白。
[0030] 圖1A、融合表達His標簽、FLAG標簽、TEV蛋白酶體識別序列、興調素結合蛋白、人 源GDF15蛋白胞外段的構建物結構示意圖。
[0031] 圖1B、純化得到TAP-tag-ex⑶F15的電泳鑒定。pET-GDF15(l)為共轉化 PGEX-Hsp90質粒后誘導表達，pET-GDF15(2)為單轉化質粒表達結果。
[0032] 圖1C、將純化的TAP-tag-ex⑶F15蛋白分別處理293T人胚腎細胞系，檢測⑶F15 蛋白活性。
[0033] 圖2A-2B、體外純化有活性的TAP-tag-ex⑶F15蛋白及其點突變失活的對照組蛋 白。
[0034] 圖2A、重組表達及鎳柱純化得到TAP-tag-ex⑶F15及TAP-tag-ex⑶F15C273S。相 同條件下得到野生型基因序列正確及突變型擁有一個氨基酸突變的TAP-tag-exGDF15蛋 白。
[0035] 圖2B、利用純化的野生型及突變型TAP-tag-ex⑶F15分別處理293T人胚腎細胞 系，檢測蛋白活性。
[0036] 圖3TAP-tag_ex⑶F15串聯(lián)親和純化技術路線示意圖。
[0037] 圖4、TAP-tag-ex⑶F15串聯(lián)親和純化后，純化出一系列蛋白。I. 6X 109293T人胚 腎細胞系，分為兩組，一組為野生型蛋白刺激（實驗組8*108細胞），一組為突變型蛋白刺激 (對照組8 X IO8細胞），刺激前細胞做饑餓12h，刺激細胞5分鐘后，收集細胞，1000 rpm離 心，棄上清，預冷PBS洗一遍，收集細胞沉淀，裂解細胞，12000rpm離心，收集細胞裂解液，串 聯(lián)親合純化細胞裂解上清（如圖3所示技術路線），收集最終蛋白產(chǎn)物，聚丙烯凝膠電泳，進 行銀染，將實驗組與對照組銀染結果相比，取實驗組中特異條帶進行質譜檢測。
[0038] 圖5A-5C、利用小分子抑制劑鑒定純化出的GNB1，MMl，CAMKII等蛋白存在于 ⑶F15的信號通路上
[0039] 圖5A、可能存在于⑶F15信號通路上的蛋白及其小分子抑制劑示意圖。
[0040] 圖5B-C、細胞預處理（饑餓12h)后，先用適宜濃度的小分子刺激后，再做蛋 白刺激，蛋白刺激條件同上所述。1.非刺激；2.單Anismycin刺激30min;3.單PMA 刺激15min ;4.單用野生型ex⑶F15刺激5min ;5. KN-62 (CaMK II抑制劑）刺激Ih ; 6.KN-93(CaMK II抑制劑）刺激 30min;7.GTP14564[Class IIIreceptor tyrosine kinase (RTK)抑制劑刺激 2h ;8. PF562271 (FAK ;RTKs 抑制劑）刺激 30min ;9. PD98059 (MEK 特異性抑制劑）刺激 Ih ;10· CP-724714(ErbB2 抑制劑）刺激 2h ;11· Dynasore(Inhibits GTPase activity of Dynaminl/2)刺激 30min ; 12.單用 IOul DMSO 作為對照（大多 數(shù)抑制劑溶于DMS0) ; 13.單用點突變體蛋白刺激5min ; 14. CCR2拮抗劑刺激30min ; 15.6&116111(阻滯(^￥-依賴的細胞活性）刺激301^11;16^1^-8鹽酸鹽（胞內0 &2+拮 抗劑）刺激Ih ;17· BIBX1382Dihydrochloride(高選擇性EGFR-激酶抑制劑）刺激Ih ;