多肽多孔質(zhì)體及其制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種以來自蛛絲蛋白質(zhì)的多肽為原料的多肽多孔質(zhì)體及其制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 多肽水凝膠在人工軟骨等生物體材料等中被使用。在專利文獻(xiàn)1中提出了一種將 絲素蛋白溶解于聚乙二醇等的吸濕聚合物的水凝膠或發(fā)泡體。在專利文獻(xiàn)2中公開有一種 以蜘蛛絲為原料、進(jìn)行光交聯(lián)的凝膠。 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)
[0003] 專利文獻(xiàn)1:日本特表2007-515391號(hào)公報(bào) 專利文獻(xiàn)2:日本特表2008-506409號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】
發(fā)明所要解決的課題
[0004] 但是，現(xiàn)有法中所提出的溶劑的尿素水溶液，其溶解蛛絲蛋白質(zhì)的力弱，胍水溶液 或六氟異丙醇（HFIP)等價(jià)格昂貴，且溶劑殘存時(shí)，難以適用于生物體。另外，關(guān)于現(xiàn)有的絲 素蛋白的發(fā)泡體，水分吸收性不清楚。
[0005] 本發(fā)明為了解決上述現(xiàn)有的問題，提供一種水分吸收性優(yōu)異的多肽多孔質(zhì)體，另 外，提供一種對生物體的適用優(yōu)異的多肽多孔質(zhì)體及其制造方法。 用于解決課題的技術(shù)方案
[0006] 本發(fā)明的多肽多孔質(zhì)體為來自蛛絲蛋白質(zhì)的多肽多孔質(zhì)體，其特征在于，所述多 肽含有非水溶性多肽，表觀密度為〇. lg/cm3以下。
[0007] 本發(fā)明的多肽多孔質(zhì)體的制造方法的特征在于，包括：使來自蛛絲蛋白質(zhì)的多肽 溶解于選自由下述（A)~（C)構(gòu)成的組中的至少一種溶解用溶劑而得到多肽的溶液的溶液 生成工序；通過將所述溶液生成工序中生成的溶液替換為水溶性溶劑而得到多肽凝膠的工 序；和將所述多肽凝膠進(jìn)行干燥的工序。 ㈧二甲基亞砜 (B) 在二甲基亞砜中加入有無機(jī)鹽的溶液 (C) 在N，N-二甲基甲酰胺中加入有無機(jī)鹽的溶液 予以說明，在此所說的"使多肽溶解于溶解用溶劑"包含使多肽完全溶解于溶解用溶 劑、和通過使多肽的微粒分散于溶解用溶劑中而成為使多肽的微粒實(shí)質(zhì)上溶解于溶解用溶 劑的形態(tài)這兩者。以下，在相同的意義中使用。 發(fā)明效果
[0008] 本發(fā)明在制作多肽溶液時(shí)使用特定的溶劑，通過替換為水溶性溶劑而取得多肽凝 膠并進(jìn)行干燥，由此可以制造幾乎不含有殘存溶劑或殘存溶液非常少的多肽多孔質(zhì)體，由 此，可以提供對生物體的適用優(yōu)異的多肽多孔質(zhì)體。另外，本發(fā)明的多肽多孔質(zhì)體通過表觀 密度充分地縮小而內(nèi)部的空隙量增大，因此，發(fā)揮高的水分吸收性。該多孔質(zhì)體也稱為干凝 膠（xerogel)，為在固相的骨架中具有空隙的網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)體。此外，本發(fā)明中使用的溶劑為在 丙烯酸系纖維或聚酰亞胺的制造中所使用的溶劑，也具有成本廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0009] 圖1是本發(fā)明的一實(shí)施例的多肽多孔質(zhì)體的光學(xué)照片。 圖2是本發(fā)明的一實(shí)施例的多肽多孔質(zhì)體的掃描型電子顯微鏡（SEM)的倍率70的照 片。 圖3是本發(fā)明的一實(shí)施例的多肽多孔質(zhì)體的掃描型電子顯微鏡（SEM)的倍率200的照 片。 圖4是本發(fā)明的一實(shí)施例的多肽多孔質(zhì)體的掃描型電子顯微鏡（SEM)的倍率1，000的 照片。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 本發(fā)明的蛋白質(zhì)使用來自蛛絲蛋白質(zhì)的多肽。來自蛛絲蛋白質(zhì)的多肽只要是來自 天然型蛛絲蛋白質(zhì)或類似的多肽即可，沒有特別限定。例如包含天然型蛛絲蛋白質(zhì)的變異 體、類似體或衍生物等。從堅(jiān)韌性優(yōu)異的觀點(diǎn)出發(fā)，上述重組蛛絲蛋白質(zhì)優(yōu)選為來自蜘蛛的 大壺狀腺中產(chǎn)生的大吐絲管牽引絲蛋白質(zhì)的重組蛛絲蛋白質(zhì)。作為上述大吐絲管牽引絲蛋 白質(zhì)，可列舉來自美國絡(luò)新婦蛛（Nephila clavipes)的大壺狀腺絲蛋白MaSpl或MaSp2、來 自十字圓蛛（Araneus diadematus)的 ADF3 或 ADF4 等。
[0011] 另外，上述重組蛛絲蛋白質(zhì)可以為來自蜘蛛的小壺狀腺中所產(chǎn)生的小吐絲管牽 引絲的重組蛛絲蛋白質(zhì)。作為上述小吐絲管牽引絲蛋白質(zhì)，可列舉來自美國絡(luò)新婦蛛 (Nephila clavipes)的小壺狀腺絲蛋白 MiSpl 或 MiSp2。
[0012] 此外，上述重組蛛絲蛋白質(zhì)可以為來自蜘蛛的鞭毛狀腺（flagelliform gland)中 所產(chǎn)生的橫絲蛋白質(zhì)的重組蛛絲蛋白質(zhì)。作為上述橫絲蛋白質(zhì)，可列舉例如來自美國絡(luò)新 婦蛛（Nephila clavipes)的鞭毛狀絲蛋白質(zhì)（flagelliform silk protein)等。
[0013] 作為來自所述大吐絲管牽引絲蛋白質(zhì)的多肽，可列舉含有式I :REP1-REP2(1)所 示的氨基酸序列的單元2個(gè)以上、優(yōu)選4個(gè)以上、更優(yōu)選6個(gè)以上的多肽。予以說明，在來 自所述大吐絲管牽引絲蛋白質(zhì)的組多肽中，式（I) :REP1_REP2(1)所示的氨基酸序列的單 元可以相同，也可以不同。上述式（1)中，REPl是指聚丙氨酸。在所述REPl中，連續(xù)排列 的丙氨酸優(yōu)選為2殘基以上，更優(yōu)選為3殘基以上，進(jìn)一步優(yōu)選為4殘基以上，特別優(yōu)選為5 殘基以上。另外，在所述REPl中，連續(xù)排列的丙氨酸優(yōu)選為20殘基以下，更優(yōu)選為16殘基 以下，進(jìn)一步優(yōu)選為14殘基以下，特別優(yōu)選為12殘基以下。上述式（1)中，REP2為由10~ 200殘基的氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，所述氨基酸序列中所含的甘氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、 脯氨酸及丙氨酸的總計(jì)殘基數(shù)相對于氨基酸殘基數(shù)整體為40%以上，優(yōu)選為50%以上，更 優(yōu)選為60%以上。
[0014] 在大吐絲管牽引絲中，所述REPl相當(dāng)于在纖維內(nèi)形成結(jié)晶β片材的結(jié)晶區(qū)域，所 述REP2相當(dāng)于在纖維內(nèi)更具有柔軟性、且大部分欠缺有規(guī)則的結(jié)構(gòu)的無定型區(qū)域。而且， 所述[REP1-REP2]相當(dāng)于由結(jié)晶區(qū)域和無定型區(qū)域構(gòu)成的重復(fù)區(qū)域（重復(fù)序列），為牽引絲 蛋白質(zhì)的特征的序列。
[0015] 作為含有上述式I :REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列的單元2個(gè)以上的多肽，可 列舉例如具有序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3及序列號(hào)4中的任一序列號(hào)所;^的氨基酸序列 的來自ADF3的重組蛛絲蛋白質(zhì)。序列號(hào)1所示的氨基酸序列相當(dāng)于在從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲 得的ADF3的部分的氨基酸序列（NCBI的基因庫的登錄號(hào)：AAC47010、GI :1263287)的N末 端附加有由起始密碼子、HislO標(biāo)簽及HRV3C蛋白酶（Human rhinovirus 3C蛋白酶）識(shí)別 位點(diǎn)構(gòu)成的氨基酸序列（序列號(hào)5)的氨基酸序列的從第1殘基至第631殘基的氨基酸序 列。序列號(hào)2所示的氨基酸序列為在N末端附加有由起始密碼子、HislO標(biāo)簽及HRV3C蛋 白酶（Human rhinovirus3C蛋白酶）識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)成的氨基酸序列（序列號(hào)5)的ADF3的氨 基酸序列（NCBI的基因庫的登錄號(hào)：AAC47010、GI :1263287)中，使第1~13號(hào)的重復(fù)區(qū) 域以成為大約2倍的方式增加，同時(shí)以在第1154號(hào)氨基酸殘基上終止的方式使翻譯變異的 氨基酸序列。序列號(hào)3所示的氨基酸序列為在從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得的ADF3的部分的氨基 酸序列（NCBI的基因庫的登錄號(hào)：AAC47010、GI :1263287)的N末端附加有由起始密碼子、 HislO標(biāo)簽及HRV3C蛋白酶（Human rhinovirus 3C蛋白酶）識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)成的氨基酸序列 (序列號(hào)5)的氨基酸序列。序列號(hào)4所示的氨基酸序列為在N末端附加有由起始密碼子、 HislO標(biāo)簽及HRV3C蛋白酶（Human rhinovirus 3C蛋白酶）識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)成的氨基酸序列 (序列號(hào)5)的ADF3的氨基酸序列（NCBI的基因庫的登錄號(hào)：AAC47010、GI :1263287)中， 使第1~13號(hào)的重復(fù)區(qū)域以成為大約2倍的方式增加的氨基酸序列。另外，作為含有上述 式I :REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列的單元2個(gè)以上的多肽，可以使用包含在序列號(hào)1、 序列號(hào)2、序列號(hào)3及序列號(hào)4中的任一序列號(hào)所示的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)的氨基酸被 替換、缺失、插入和/或附加的氨基酸序列、且具有由結(jié)晶區(qū)域和無定型區(qū)域構(gòu)成的重復(fù)區(qū) 域的多肽。
[0016] 本發(fā)明中，"1個(gè)或多個(gè)"是指例如1~40個(gè)、1~35個(gè)、1~30個(gè)、1~25個(gè)、1~ 20個(gè)、1~15個(gè)、1~10個(gè)、或1個(gè)或數(shù)個(gè)。另外，本發(fā)明中，"1個(gè)或數(shù)個(gè)"是指1~9個(gè)、 1~8個(gè)、1~7個(gè)、1~6個(gè)、1~5個(gè)、1~4個(gè)、1~3個(gè)、1~2個(gè)、或1個(gè)。
[0017] 作為來自上述小吐絲管牽引絲蛋白質(zhì)的重組蛛絲蛋白質(zhì)，可列舉含有式2: REP3(2)所示的氨基酸序列的多肽。在上述式2中，REP3是指由（Gly-Gly-Z)m(Gly-Ala) I (A) r構(gòu)成的氨基酸序列，Z是指任意一個(gè)氨基酸，特別優(yōu)選為選自由Ala、Tyr及Gln構(gòu)成 的組中的一個(gè)氨基酸。另外，m優(yōu)選為1~4, 1優(yōu)選為0~4, r優(yōu)選為1~6。
[0018] 在蛛絲中，小吐絲管牽引絲從蜘蛛的巢穴的中心卷繞成螺旋狀，作為巢穴的增強(qiáng) 材料使用，或作為包住捕捉的獵獲物的絲被利用。已知有與大吐絲管牽引絲相比時(shí)，拉伸強(qiáng) 度差，但伸縮性高。其認(rèn)為是因?yàn)?，在小吐絲管牽引絲中，許多結(jié)晶區(qū)域由甘氨酸和丙氨酸 交替地連結(jié)的區(qū)域形成，因此，與僅由丙氨酸形成結(jié)晶區(qū)域的大吐絲管牽引絲相比，結(jié)晶區(qū) 域的氫鍵容易變?nèi)酢?br>[0019] 作為來自上述橫絲蛋白質(zhì)的重組蛛絲蛋白質(zhì)，可列舉含有式3 :REP4(3)所示的氨 基酸序列的多肽。在上述式3中，REP4是指由（Gly-Pro-Gly-Gly-