長效化PEG-rExendin-4改構(gòu)體偶聯(lián)物的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種長效化的II型糖尿病治療藥物，應(yīng)用基因重組Exendin-4改構(gòu)體 與特定Y型聚乙二醇衍生物偶聯(lián)的新型制備工藝，生物學(xué)活性穩(wěn)定，體內(nèi)代謝時(shí)間明顯延 長。屬于基因工程多肽藥物制備和長效蛋白藥物開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] GLP-I能在人體內(nèi)血糖濃度增高時(shí)，刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素降低血糖，不會(huì) 引起低血糖和體重增加，能保護(hù)患者的β細(xì)胞和修復(fù)受損的β細(xì)胞，延緩疾病進(jìn)程。天然 的GLP-I在體內(nèi)會(huì)被DPP-IV迅速降解，其半衰期只有1-2分鐘，限制了其本身作為藥物開 發(fā)的價(jià)值。近年來GLP-I類似物作為II型糖尿病的治療藥物倍受青睞，由美國Amylin和 Elililly公司共同開發(fā)的Exenatide (商品名Byetta)已于2005年在美國上市，2011年在 中國上市。Exendin-4是從希拉毒蜥（Heloderma suspectum)唾液中分離得到的含有39個(gè) 氨基酸序列的GLP-I類似物，與天然的GLP-I有53%的結(jié)構(gòu)同源性，能夠與GLP-I受體結(jié) 合。通過與GLP-I受體結(jié)合發(fā)揮促胰島素分泌的作用，有效降低空腹和餐后血糖的作用，用 于治療II型糖尿病。并且Exendin-4對(duì)DPP-IV具有很好的耐受性，在體內(nèi)半衰期約2小 時(shí)，患者需要每日注射給藥2次，患者使用不便，因此開發(fā)長效劑型或者非注射途徑給藥的 制劑是該類藥物發(fā)展的趨勢。
[0003] 聚合物修飾技術(shù)是上世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種常用修飾技術(shù)，其中尤以聚乙 二醇化技術(shù)為代表。該技術(shù)是將聚乙二醇（PEG)與蛋白藥物化學(xué)結(jié)合，形成PEG與蛋白質(zhì) 或多肽的偶聯(lián)物，制備長效蛋白質(zhì)和多肽藥物的制劑。
[0004] 用聚乙二醇對(duì)蛋白質(zhì)藥物修飾具有很多優(yōu)點(diǎn)：a)增大蛋白質(zhì)藥物的分子量，減少 被腎小球過濾的頻率，提高藥物在體內(nèi)的半衰期；b)保護(hù)蛋白質(zhì)免受蛋白酶的降解；c)屏 蔽外源性蛋白質(zhì)的免疫原性，減少副作用；d)蛋白質(zhì)被修飾后仍能保持一定的活性，通過 在體內(nèi)長時(shí)間循環(huán)，起到穩(wěn)定的治療效果；e)聚乙二醇是FDA已經(jīng)批準(zhǔn)的藥用材料，只要解 決修飾劑和修飾工藝中的關(guān)鍵技術(shù)，就能迅速得到批準(zhǔn)并投入應(yīng)用。
[0005] 目前聚乙二醇化技術(shù)已發(fā)展到第二代------定點(diǎn)聚乙二醇化技術(shù) (Site-specific PEGylation)。定點(diǎn)聚乙二醇化技術(shù)可以特異地修飾蛋白藥物的某一特定 氨基酸，從而避免隨機(jī)修飾的盲目性。這樣既可以選擇遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)多肽活性中心結(jié)構(gòu)，減少 非定點(diǎn)聚乙二醇化所帶來的生物活性降低；又能選擇性屏蔽某些抗原位點(diǎn)，減少免疫原性。 同時(shí)，偶聯(lián)物結(jié)構(gòu)與活性保持高度一致。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的首要技術(shù)課題是提供一種有利于工業(yè)化生產(chǎn)，且能明顯減少用 藥次數(shù)，用于治療II型糖尿病的長效藥物。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案：在rExendin-4非活性區(qū)C末端突變或插入一個(gè)Cys，以活化 的Y型馬來酰亞胺聚乙二醇衍生物為PEG修飾劑，rExendin-4中唯一的巰基加成到Y(jié)型PEG 的馬來酰亞胺的雙鍵上，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的定點(diǎn)修飾。
[0008] rExendin-4原序列SEQ見序列表。
[0009] 本發(fā)明中rExendin-4改構(gòu)體采用基因重組法，將Exendin-4原序列中第39位絲 氨酸（Ser)基因突變?yōu)榘腚装彼幔–ys)，或在其基因序列中終止密碼子TGA前直接插入編碼 一個(gè)半胱氨酸的三聯(lián)體密碼子（TGT)，然后直接在大腸桿菌系統(tǒng)中發(fā)酵表達(dá)。與化學(xué)合成方 法相比，生產(chǎn)簡便，安全性好，無毒性試劑，制造成本低，且易于規(guī)模放大。
[0010] 本發(fā)明所選用聚乙二醇分子為Y型馬來酰亞胺聚乙二醇衍生物（結(jié)構(gòu)見下），分子 量為40, 000道爾頓。相比直鏈或其他分子量低于40, 000的支鏈聚乙二醇衍生物，具有更 長的體內(nèi)半衰期。
[0012] Y型聚乙二醇修飾為巰基定點(diǎn)單取代偶聯(lián)反應(yīng)。
[0013] 本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)課題是提供上述rExendin-4改構(gòu)體與Y型聚乙二 醇偶聯(lián)物的制備工藝。
[0014] 所述長效化PEG-rExendin-4的制備方法，控制緩沖體系的鹽濃度范圍在10~ lOOmmol/L之間；pH值范圍在6. 0~9. 0之間，優(yōu)選7. 5~8. 5之間；加入重組Exendin-4 與Y型馬來酰亞胺聚乙二醇衍生物反應(yīng)，控制兩反應(yīng)物的摩爾質(zhì)量比范圍在0. 5~10之 間，優(yōu)選3~7之間；反應(yīng)時(shí)間范圍在0. 5~24小時(shí)之間，優(yōu)選1~5小時(shí)之間；控制反應(yīng) 溫度范圍在4°C~37°C之間，優(yōu)選20°C~30°C之間。
[0015] 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過稀釋、Q-Sepharose離子交換色譜層析分離純化，收集各組分，用高 效液相色譜法分別鑒定，收集主產(chǎn)物峰，即得一個(gè)聚乙二醇分子連接一個(gè)重組Exendin-4 的 PEG-rExendin-4〇
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的技術(shù)進(jìn)步。
[0017] 主要表現(xiàn)在以下3個(gè)方面：
[0018] 本發(fā)明所提供的聚乙二醇化重組Exendin-4藥物的優(yōu)點(diǎn)是提供在體內(nèi)更長時(shí)間 的血液水平，具有明顯的長效性，減少注射次數(shù)而使患者容易接受；
[0019] 本發(fā)明所述的重組Exendin-4改構(gòu)體是采用基因工程的方法，使用本研究室保藏 的菌種，用大腸桿菌表達(dá)，經(jīng)發(fā)酵、純化后獲得，純度大于97%，且保持較高的生物活性；相 比化學(xué)合成方法，具有安全高效、生產(chǎn)簡易穩(wěn)定、易于規(guī)模放大且周期短、成本低等優(yōu)點(diǎn)；
[0020] 本發(fā)明采用對(duì)重組Exendin-4改構(gòu)體的C末端定點(diǎn)單取代修飾方法，即以活化的Y 型馬來酰亞胺聚乙二醇衍生物和重組Exendin-4改構(gòu)體中唯一的巰基通過共價(jià)鍵方式連 接，使產(chǎn)物的穩(wěn)定性、均一性大大提高，容易純化，純化產(chǎn)物的生物學(xué)活性能夠較好地保留， 體內(nèi)半衰期明顯延長。
[0021] 附圖概述
[0022] 圖lrExendin-4與PEG不同摩爾比例修飾反應(yīng)結(jié)果的HPLC鑒別圖，其中a) rExendin-4 : PEG = I : 3 ；b) rExendin-4 : PEG = I : 5 ；c) rExendin-4 : PEG = I : 7 ;
[0023] 圖2rExendin-4與PEG不同pH值條件修飾反應(yīng)結(jié)果的HPLC鑒別圖，其中a)pH = 7. 0 ；b)pH = 7. 5c) pH = 8. 0 ；d)pH = 8. 5 ；
[0024] 圖3rExendin-4與PEG反應(yīng)物離子交換色譜圖，其中Pl :PEG和次產(chǎn)物；P2 :主產(chǎn) 物 PEG-rExendin-4 ;P3 :rExendin_4
[0025] 圖4PEG-rExendin