一種基于單引物擴(kuò)增反應(yīng)的dna分子標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于單引物擴(kuò)增反應(yīng)的DNA分子標(biāo)記方法。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA分子標(biāo)記是以個(gè)體間核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，直接在DNA水平上 檢測生物個(gè)體之間的差異，能夠從DNA水平直接反映生物的遺傳本質(zhì)，是生物個(gè)體DNA水平 上遺傳變異的直接反映。它具有數(shù)量豐富、信息量大、多態(tài)性高、檢測不受季節(jié)、環(huán)境和個(gè)體 發(fā)育階段的影響、檢測手段簡單迅速等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系評 價(jià)、指紋圖譜構(gòu)建、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、QTL或基因定位與克隆和分子標(biāo)記輔助選擇育種等 領(lǐng)域。
[0003] 自1980年首次提出分子標(biāo)記的概念以來，DNA分子標(biāo)記的研宄不斷有文獻(xiàn)報(bào)道， 特別是上世紀(jì)90年代以來，發(fā)展十分迅速。目前被廣泛應(yīng)用的DNA分子標(biāo)記技術(shù)主要 有：DNA 限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)、 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、簡單序列重復(fù)間多態(tài) 性（Inter-Simple Sequence Repeats, ISSR)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)、簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat, SSR)、特殊序 列擴(kuò)增區(qū)（Sequence Characterized Amplified Regions, SCAR)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài) 性（Sequence-Related Amplified Polymorphism, SRAP)、革El位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性（Target Region Amplified Polymorphism, TRAP)、目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（Start Codon Targeted Polymorphism，SCoT)和單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)等 (Bostein et al.,1980 ；ffilliams et al.,1990 ；Zietkiewicz et al.,1994 ；Vos et al. , 1995 ；Tautz and Renz 1984 ；Paran and Miehelmore 1993 ；Li and Quiros 2001 ；Hu and Vick 2003 ;Collard and Mackill 2009)。按照分類的不同，上述DNA分子標(biāo)記技術(shù)既 可以被分為基于分子雜交（如RFLP)和基于PCR技術(shù)這兩大類分子標(biāo)記技術(shù)，而基于PCR技 術(shù)上的DNA分子標(biāo)記技術(shù)按照所用引物性質(zhì)的不同可以分為基于隨機(jī)引物擴(kuò)增（如RAPD) 的分子標(biāo)記技術(shù)和基于特異引物擴(kuò)增（如SSR)的分子標(biāo)記技術(shù)，按照所用引物數(shù)量的不 同可分為基于單引物擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)和基于雙引物擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)（熊發(fā)前等， 2010a);也可以被分為隨機(jī)DNA分子標(biāo)記、目的基因分子標(biāo)記和功能性分子標(biāo)記（Andersen and Lilbberstedt 2003) 〇
[0004] 常規(guī)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)是使用一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的，而有一大類DNA分子 標(biāo)記技術(shù)只使用一條單引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，也被稱為基于單引物擴(kuò)增反應(yīng)的DNA分子標(biāo)記 技術(shù)。單引物擴(kuò)增反應(yīng)是指在一個(gè)PCR反應(yīng)中只使用一條單引物，這一條單引物同時(shí)充當(dāng) 上游引物和下游引物的作用，當(dāng)這一條單引物在基因組DNA上的兩結(jié)合位點(diǎn)之間的距離不 是很遠(yuǎn)的時(shí)候，兩結(jié)合位點(diǎn)之間的序列便可得到有效擴(kuò)增。自上世紀(jì)90年代以來，越來越 多的基于單引物擴(kuò)增反應(yīng)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)被開發(fā)出來并得到越來越多地關(guān)注和應(yīng)用， 比如RAPD(Williams J G K，Kubelik A R，LivakK J，et al. DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers Are Usefulas Genetic Markers[J]. Nucl Acid Res. 1990， 18 :6531-6535), ISSR(Zietkiewicz et al. , 1994), ISTR(Rohde 1996), IRAP(Kalendar et al·，1999)、MP(Chang et al. ,2001)、SCoT(Collard and Mackill 2009a;熊發(fā)前 等，2009)、CDDP(Collard and Mackill 2009b;熊發(fā)前等，2010b)、iPBS(Kalendar et al·，2010)、HF〇-TAG(Levi and Wechter 2010)和 CBDP(Singh et al·，2013)。這些基于單 引物擴(kuò)增反應(yīng)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)的技術(shù)核心是單引物的設(shè)計(jì)。其中，RAH)技術(shù)中所使用 的單引物是完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的；ISSR技術(shù)中所使用的單引物是根據(jù)簡單重復(fù)序列（SSR)來設(shè) 計(jì)的；ISTR技術(shù)和IRAP技術(shù)中所使用的單引物是根據(jù)LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中的LTR序列來設(shè) 計(jì)的；IMP技術(shù)中所使用的單引物是根據(jù)MITE轉(zhuǎn)座子中的TIR序列來設(shè)計(jì)的；SCoT技術(shù)中 所使用的單引物是根據(jù)植物基因中的ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性序列來設(shè)計(jì)的； CDDP技術(shù)中所使用的單引物是根據(jù)不同物種中同時(shí)存在的保守DNA序列或蛋白質(zhì)序列（如 轉(zhuǎn)錄因子WRKY、MYB、ERF、KNOX和開花控制MADS-BOX及生長素結(jié)合蛋白ABPl)來設(shè)計(jì)的； iPBS技術(shù)中所使用的單引物是根據(jù)LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中毗鄰5' LTR序列的保守性的tRNA 結(jié)合位點(diǎn)（Primer Binding Site, PBS)序列來設(shè)計(jì)的；HFO-TAG技術(shù)中所使用的單引物是 根據(jù)存在于大量西瓜的unigenes中的長度為8-10bp的高頻率短序列來設(shè)計(jì)的；CBDP技術(shù) 中所使用的單引物是根據(jù)植物啟動(dòng)子中存在保守一致序列"GGCCAATCT"來設(shè)計(jì)的?？傊?， 自上世紀(jì)九十年代以來，DNA分子標(biāo)記技術(shù)的開發(fā)及應(yīng)用進(jìn)展十分迅速，新的DNA分子標(biāo)記 技術(shù)不斷出現(xiàn)，基于單引物擴(kuò)增反應(yīng)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)也在同步涌現(xiàn)。一般來說，后面出 現(xiàn)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)大都吸收了前面的優(yōu)點(diǎn)且克服了它們的部分不足，使之不斷優(yōu)化， 但現(xiàn)有的DNA分子標(biāo)記技術(shù)缺陷仍然十分明顯，存在著引物退火溫度低、引物設(shè)計(jì)復(fù)雜、弓丨 物數(shù)量少、操作重復(fù)性差和趨向于擴(kuò)增非功能編碼區(qū)域等缺點(diǎn)。
[0005] 因此，開發(fā)一種引物設(shè)計(jì)簡便、引物合成費(fèi)用低、利用率高、引物退火溫度高，操作 簡單、高效、重復(fù)性好、特異性高、多態(tài)性高的新型DNA分子標(biāo)記技術(shù)十分必要。目前，還沒 有一種針對基因外顯子區(qū)域擴(kuò)增的基于單引物擴(kuò)增反應(yīng)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的發(fā)明目的在于：針對上述存在的問題，提供一種針對基因外顯子區(qū)域擴(kuò) 增的基于單引物擴(kuò)增反應(yīng)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，彌補(bǔ)現(xiàn)有分子標(biāo)記技術(shù)的不足之處。本發(fā) 明所提供的DNA分子標(biāo)記方法除具有操作簡單、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、數(shù)量豐富、特異性高、 多態(tài)性高、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)外，因提供的單引物設(shè)計(jì)是根據(jù)真核生物基因組中的基因外顯 子區(qū)域富含GC的原理來設(shè)計(jì)的，引物可以在真核生物間通用，大大減少了引物的合成費(fèi) 用，也大大提高了引物的使用利用率。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0008] 一種基于單引物擴(kuò)增反應(yīng)的DNA分子標(biāo)記方法，包括以下步驟：根據(jù)真核生物基 因組中基因外顯子區(qū)域富含GC設(shè)計(jì)并合成單引物，提取樣品基因組DNA作為模板，利用設(shè) 計(jì)好的單引物和所提取的樣品DNA模板在常規(guī)PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序下進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠電泳分離后檢測單引物在基因組基因外顯子 區(qū)域中的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)間的多態(tài)性。
[0009] 所述的單引物是指一個(gè)PCR反應(yīng)中只使用一條固定引物，這一條固定引物同時(shí)充 當(dāng)正向引物和反向引物的角色，該固定引物是基于真核生物基因組中基因區(qū)富含GC來設(shè) 計(jì)的，引物序列長度17bp，5'端的6個(gè)堿基填充序列為富含AT堿基的限制性內(nèi)切酶酶切位 點(diǎn)序列，中間核心區(qū)序列是由8個(gè)GC堿基隨機(jī)排列組成，這14個(gè)堿基組成核心序列，最后 3'端是3個(gè)選擇性隨機(jī)堿基。
[0010] 進(jìn)一步地，所述單引物的序列可以為下述Mmel~Mm