金槍魚類及其深加工產(chǎn)品種類鑒定的熒光定量pcr方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種適用于金槍魚類及其深加工產(chǎn)品種類鑒定的熒光定量PCR檢測(cè) 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金槍魚類（Tuna)，又叫鮪魚、吞拿魚，是硬骨魚綱（Osteichthyes)、魚盧形目 (Pereiformes)、鯖科（Scombridae)魚類中具有胸甲（指胸區(qū)和側(cè)線前部明顯擴(kuò)大的鱗片） 的幾個(gè)屬魚類的總稱。金槍魚類身體呈紡錘型、粗壯，適于快速游泳。它們廣泛分布于太平 洋、大西洋和印度洋的溫帶和熱帶水域，棲息于水深100~500m的大洋深處，屬大洋暖水性 高度洄游魚類。常見的金槍魚類有5個(gè)屬17個(gè)種，其中經(jīng)濟(jì)價(jià)值較大的有6種，分別是金 槍魚屬的長(zhǎng)鰭金槍魚（Thunnus alalunga)、黃鰭金槍魚（Thunnus albacares)、大眼金槍魚 (Thunnus obesus)、金槍魚（Thunnus thynnus)、藍(lán)鰭金槍魚（Thunnus maccoyii)和麵屬的 正麵（Katsuwonus pelamis) 〇
[0003] 金槍魚屬于紅肉魚類，肉質(zhì)柔嫩、鮮美，蛋白質(zhì)含量很高，氨基酸配比優(yōu)越；富含 DHA、EPA等具有生物活性的多不飽和脂肪酸，可促進(jìn)大腦發(fā)育、有效預(yù)防心腦血管疾病；同 時(shí)，蛋氨酸、?；撬?、礦物質(zhì)和維生素含量豐富，具有高蛋白、低熱量和低脂肪的特點(diǎn)，是國(guó) 際營(yíng)養(yǎng)協(xié)會(huì)推薦的綠色無污染健康美食。金槍魚的消費(fèi)形式主要有罐頭制品和生魚片。生 魚片市場(chǎng)所要求的金槍魚規(guī)格比較大，以藍(lán)鰭金槍魚、大眼金槍魚和黃鰭金槍魚為主，其中 黃鰭金槍魚是上等的生魚片原料。長(zhǎng)鰭金槍魚和鰹魚通常用來制作金槍魚罐頭。日本、西歐 和美國(guó)是金槍魚的主要消費(fèi)市場(chǎng)。日本多以生魚片的方式食用，一般年消費(fèi)量80-90萬噸， 約占整個(gè)世界金槍魚消費(fèi)總量的30%左右。歐洲和美國(guó)則以金槍魚罐頭消費(fèi)為主，品種包 括水漬金槍魚罐頭、色拉金槍魚罐頭、油漬金槍魚罐頭等。由于我國(guó)遠(yuǎn)洋金槍魚漁業(yè)起步較 晚，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上金槍魚長(zhǎng)期被視為高級(jí)食品。由于具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，近年來國(guó)際上金槍 魚類產(chǎn)品的消費(fèi)量逐漸上升，但其遠(yuǎn)洋捕撈資源已日漸枯竭。除6種經(jīng)濟(jì)價(jià)值比較高的優(yōu) 質(zhì)金槍魚外，另外一些相似的品種如鮪（Euthynnus affinis),扁舵鰹（Auxis thazard)，東 方狐鰹（Sarda orientalis)也常常用于生產(chǎn)金槍魚罐頭、魚酥等產(chǎn)品。以不同原魚料所生 產(chǎn)的金槍魚產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有很大區(qū)別，價(jià)格也千差萬別；并且其有毒、過敏物質(zhì)如組胺、汞 的含量也各不相同，對(duì)嬰幼兒或過敏體質(zhì)的人可能會(huì)引發(fā)食物中毒事件。雖然很多國(guó)家都 有相應(yīng)的法規(guī)，規(guī)定在金槍魚產(chǎn)品的標(biāo)簽中明確其種類和來源。然而，摻假造假的判定和標(biāo) 簽制度的有效實(shí)施，必須是建立在快速、準(zhǔn)確的金槍魚品種鑒定的基礎(chǔ)上的，但目前該領(lǐng)域 國(guó)內(nèi)的研宄還是空白。因此，為了杜絕某些不法商販以次充好的欺詐行為、維護(hù)消費(fèi)者的知 情權(quán)，迫切需要建立靈敏、可靠的檢測(cè)方法和檢測(cè)體系來鑒定金槍魚類產(chǎn)品原魚料的品種。
[0004] 目前，已報(bào)道的金槍魚種類鑒定的方法有傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)法、蛋白質(zhì)電泳法和DNA分 子遺傳標(biāo)記方法。形態(tài)學(xué)方法依賴于專業(yè)人士的長(zhǎng)期工作經(jīng)驗(yàn)，對(duì)親緣關(guān)系相近的相似種 的判斷并非有效。而且對(duì)于市面上常見的加工過金槍魚產(chǎn)品（生魚片、罐頭類），可供種類 鑒別的形態(tài)學(xué)特征幾乎不存在；蛋白質(zhì)分析方法不適用于深加工產(chǎn)品，因?yàn)楫a(chǎn)品加工過程 中的熱處理使蛋白質(zhì)的生化特性及其結(jié)構(gòu)完整性都被破壞；而基于DNA技術(shù)的分子生物學(xué) 方法，就顯示出明顯優(yōu)勢(shì)。DDNA比蛋白質(zhì)耐熱性強(qiáng)。盡管DNA在加工過程中也會(huì)被降解， 但是仍然能提取出小片段的DNA。2)作為生物體的遺傳物質(zhì)，DNA分子能夠提供更多信息。 3)DNA分子穩(wěn)定，不受組織類型、年齡及生理狀態(tài)等因素的影響。
[0005] DNA分子技術(shù)用于種類鑒定有多種常見方法，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP) 標(biāo)記、單堿基多態(tài)性（SNP)標(biāo)記、微衛(wèi)星（microsatellite)標(biāo)記、DNA條形碼技術(shù)（DNA barcode)、熒光定量PCR技術(shù)等。
[0006] RFLP首先需要對(duì)目標(biāo)DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后選擇合適的限制性內(nèi)切酶切 割擴(kuò)增片段，通過瓊脂糖凝膠電泳獲得不同物種的限制性酶切片段圖譜。該方法花費(fèi)低， 操作簡(jiǎn)單，但也存在諸多缺點(diǎn)：1)由于存在種內(nèi)變異以及不同密碼子的簡(jiǎn)并性特征，同一 物種不同個(gè)體可能存在不同的限制片段酶切圖譜；2)除生魚片外，金槍魚深產(chǎn)品（如金槍 魚罐頭）在加工過程中通常使用長(zhǎng)時(shí)間（>15min)高溫（>115°C )處理，DNA分子常降解為 100-200bp的小片段，這可能嚴(yán)重影響酶切片段的多態(tài)性的判斷。
[0007] SNP和microsatellite標(biāo)記常用于金槍魚同種魚類的群體分析。DNA barcode 是通過對(duì)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列進(jìn)行分析從而進(jìn)行快速物種鑒定的技術(shù)，由Hebert 等（2003)首先提出。2003年，海洋生物普查研宄首次將DNA Barcode技術(shù)用于標(biāo)本編碼。 2004 年，生命條形碼聯(lián)盟（the Consortium for the Barcode of Life, CB0L)成立，支持 生物DNA條形碼研宄的發(fā)展。至今，該組織下的魚類DNA條碼（Fish Barcode of Life campaign, FISH-B0L)已經(jīng)獲得了 10267個(gè)種的DNA條形碼記錄，包含97%的魚類品種。該 方法在新物種的發(fā)掘和物種系統(tǒng)進(jìn)化分析方面非常高效，但其缺點(diǎn)是混合樣品中通常有多 種成分被同時(shí)擴(kuò)增，會(huì)造成測(cè)序結(jié)果的雜亂，因此不適用于混合樣品的鑒定。
[0008] 熒光定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新的核酸定量檢測(cè)方法，它在常規(guī)的PCR 基礎(chǔ)上加入熒光信號(hào)物質(zhì)（探針或染料），利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過程，最后 通過擴(kuò)增曲線的Ct值（熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到基礎(chǔ)信號(hào)（Base Line)時(shí)的循環(huán)數(shù)，表明PCR開 始進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期）對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。它集中了核酸雜交特異性強(qiáng)和PCR擴(kuò)增靈 敏度高的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)范圍廣（多7個(gè)數(shù)量級(jí)）、檢測(cè)極限低（lc/r)，可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行 快速準(zhǔn)確分析，被認(rèn)為是目前最可靠的核酸定量檢測(cè)技術(shù)。在我國(guó)進(jìn)出口食品的檢驗(yàn)檢疫 方面，已廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)、有害生物風(fēng)險(xiǎn)分析以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)管等多個(gè)方面。
[0009] 近年來新發(fā)展的雙重?zé)晒舛縋CR技術(shù)，即在一個(gè)反應(yīng)體系中含兩對(duì)引物和不同 熒光基團(tuán)標(biāo)記的探針，通過實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)可同時(shí)檢測(cè)兩種目標(biāo)基因，建立快捷準(zhǔn)確的雙重 熒光定量PCR方法進(jìn)行種類鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種熒光定量PCR技術(shù)，利用該技術(shù)靈敏準(zhǔn)確的 特性，分別檢測(cè)金槍魚屬的保守基因和11種金槍魚（長(zhǎng)鰭金槍魚（Thunnus alalunga)、 黃鰭金槍魚（Thunnus albacares)、大眼金槍魚（Thunnus obesus)、藍(lán)鰭金槍魚（Thunnus maccoyii)、鰹屬的正鰹（Katsuwonus pelamis)、青干金槍魚（Thunnus tonggol)、扁舵鰹 (Auxis thazard)、圓航麵（Auxis rochei)、東方狐麵（Sarda orientalis)、鮪（Euthynnus affinis)以及條紋四鰭旗魚（Tetrapturus audax))的特異基因，建立一套合適的單重和 雙重?cái)U(kuò)增和分析體系，對(duì)深加工金槍魚產(chǎn)品種類進(jìn)行快速鑒定。
[0011] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種金槍魚類及其深加工產(chǎn)品種類鑒定的熒光 定量PCR檢測(cè)方法中所用的特異性引物和探針，所述特異性引物和探針的序列至少為以下 任意一種（如表1所不）：
[0012]表 1
[0014] 作為本發(fā)明的的金槍魚類及其深加工產(chǎn)品種類鑒定的熒光定量PCR檢測(cè)方法中 所用的特異性引物和探針的改進(jìn)，還包括以下（如表2所示）：
[0015] 表 2
[0016]
[0018] 備注說明：對(duì)青干金槍魚進(jìn)行種類鑒定的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人也設(shè)計(jì)了相應(yīng)的探針，但 是根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果，發(fā)現(xiàn)使用的探針并沒有提高鑒定的特異性。而引物組的特異性 要比探針的特異性高，因此本發(fā)明只采用了青干的引物進(jìn)行種類鑒定。
[0019] 作為本發(fā)明的金槍魚類及其深加工產(chǎn)品種類鑒定的熒光定量PCR檢測(cè)方法中所 用的特異性引物和探針的進(jìn)一步改進(jìn)，還包括以下（如表3所示）：
[0020] 表 3
[0021]
[0022] 本發(fā)明還同時(shí)提供了金槍魚類及其深加工產(chǎn)品種類鑒定的熒光定量PCR檢測(cè)方 法，依次進(jìn)行以下步驟：
[0023] 1 )、待測(cè)金槍魚樣品中基因組DNA的提取，得DNA模板；
[0024] 2)、對(duì)以下11種常見金槍魚進(jìn)行特異性鑒定引物與探針的設(shè)計(jì)；
[0025] 11種常見金槍魚為：長(zhǎng)鰭金槍魚（Thunnus alalunga)、黃鰭金槍魚（Thunnus albacares)、大眼金槍魚（Thunnus obesus)、藍(lán)鰭金槍魚（Thunnus maccoyii)、麵屬的正麵 (Katsuwonus pelamis)、青干金槍魚（Thunnus tonggol)、扁航麵（Auxis thazard)、圓航麵 (Auxis rochei)、東方狐麵（Sarda orientalis)、鮪（Euthynnus affinis)以及條紋四鰭旗 魚（Tetrapturus audax)；
[0026] 3)、熒光定量PCR體系的配置；
[0027] 以基因組DNA為擴(kuò)增模板，使用上述特異性鑒定引物和探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢 測(cè)；
[0028] 4)、根據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷（即，對(duì)市售金槍魚樣品的種類鑒定，判