一種利用dna條形碼鑒別茶樹品種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及茶樹品種的鑒別方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國目前已選育了 114個(gè)國家級(jí)良種和154個(gè)省級(jí)良種，如何對這些品種進(jìn)行準(zhǔn) 確鑒定對育種者權(quán)益保護(hù)和新品種推廣等具有重要意義。茶樹新品種DUS(特異性、一致 性、穩(wěn)定性的簡稱）測試指南是中國為國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV)制訂的第一個(gè)植物 新品種DUS測試指南，它的制定為我國茶樹資源評價(jià)和保護(hù)提供了技術(shù)基礎(chǔ)和授權(quán)依據(jù)。 隨著分子標(biāo)記技術(shù)不斷發(fā)展，UPOV已將DNA標(biāo)記鑒定納入農(nóng)作物品種DUS測試內(nèi)容。DNA 分子標(biāo)記技術(shù)不僅具有穩(wěn)定性、品種間變異的可識(shí)別性、最小品種內(nèi)變異及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可 靠性，而且具有簡便、迅速等優(yōu)點(diǎn)，非常適合品種鑒定，克服了傳統(tǒng)形態(tài)標(biāo)記鑒定周期長、誤 差大、性狀差異小的缺點(diǎn)。國際植物品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟（UPOV)在BMT測試指南草案中已將構(gòu) 建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標(biāo)記方法確定為SSR和SNP。而SSR標(biāo)記因引物開發(fā)廉價(jià)、操作簡單、 易于推廣，已被UPOV生物化學(xué)和分子技術(shù)工作組驗(yàn)證為植物新品種保護(hù)最廣泛應(yīng)用的標(biāo) 記體系。UPOV雖已將作物SSR標(biāo)記鑒定納入農(nóng)作物品種DUS測試內(nèi)容，但對不同作物的測 試流程及具體方法卻沒有明確的規(guī)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對目前依靠茶樹植物學(xué)性狀對茶樹品種進(jìn)行鑒定周期長、誤差大、鑒定性狀差 異小品種困難大、對鑒定者經(jīng)驗(yàn)要求豐富等問題，本發(fā)明提供了一種簡單、快速、準(zhǔn)確利用 DNA條形碼鑒別茶樹品種的方法。
[0004] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是：一種利用DNA條形碼鑒別茶樹品種 的方法，包括以下步驟：
[0005] (I) DNA提取：分別提取數(shù)個(gè)茶樹品種的DNA ;
[0006] (2)引物篩選：篩選條帶清晰、穩(wěn)定且重復(fù)性好的數(shù)對SSR引物；
[0007] (3) PCR擴(kuò)增：將上述提取的DNA中的每個(gè)DNA分別與每對篩選的SSR引物混合配 成PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行擴(kuò)增；
[0008] (4) SSR標(biāo)記的PCR產(chǎn)物分析：將每一 PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后染色，然后采 用凝膠成像儀拍照記錄；
[0009] (5)分子條形碼的構(gòu)建：將上述記錄的每對SSR引物上的每一個(gè)品種的電泳圖上 清晰的條帶記為"1"，同一位置無帶或不易分辨的弱帶計(jì)為"〇"，建立原始數(shù)據(jù)庫；然后把 每對SSR引物上每一個(gè)品種位點(diǎn)的1、0數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為字母；再將數(shù)對SSR引物上對應(yīng)品種轉(zhuǎn) 換的字母進(jìn)行組合，形成每一個(gè)品種的DNA條形碼；
[0010] (6)鑒別：以上述DNA條形碼為標(biāo)準(zhǔn)鑒別茶樹品種的真?zhèn)巍?br>[0011] 作為優(yōu)選，采用試劑盒法提取DNA。
[0012] 作為優(yōu)選，篩選出
[0013] F:CTCCGATTACTTTCTTCC
[0014] R:GCAGGTTAGCGGTGGTTA ;
[0015] F:TAGGGTTTTAGTTTCAG
[0016] R:AACATCCTTGCCTCGTC ;
[0017] F:GTGAAGTTAGTTGTTACTCTTTTTTGG
[0018] RiAGGGGAAGTGAGGAGGCAT ；
[0019] F:ATGCTTCAGGGAGTGACCAT
[0020] R:ATTTATGCCAAACTACCAACAG
[0021] 四對SSR引物。
[0022] 作為優(yōu)選，每一 PCR反應(yīng)試劑按體積份數(shù)6. 65份ddH20、I. 0份IOng/ μ L的上述 提取的一個(gè)品種的 DNA、1. 0 份 10XBuffer、0. 7 份 25mM 的 Mg2+、0. 2 份 IOmM 的 dNTP、各 0. 1 份 10 μ M 的 primers 和 0· 25 份 2U/ μ L 的 Taq polymerase 混合配成而成。
[0023] 作為優(yōu)選，PCR擴(kuò)增條件為94°C變性3min，然后94°C變性30s，53°C退火30s，72°C 延伸50s，共30個(gè)循環(huán)，完成以上循環(huán)以后，72°C延伸IOmin，最后將PCR產(chǎn)物冷卻到室溫或 者 4。。。
[0024] 作為優(yōu)選，上述PCR擴(kuò)增重復(fù)一次，比較兩次擴(kuò)增結(jié)果，如果兩次結(jié)果不一致，PCR 擴(kuò)增再重復(fù)一次，以有兩次擴(kuò)增一致的結(jié)果為準(zhǔn)。
[0025] 作為優(yōu)選，將PCR產(chǎn)物與6Xloading buffer混合，采用10%的聚丙稀酰胺凝膠電 泳，電泳后進(jìn)行硝酸銀染色，直到有清晰條帶出現(xiàn)為止。
[0026] 作為優(yōu)選，硝酸銀染色的步驟為：①用10%乙醇和0. 5%乙酸固定5~8min ;②用 10%乙醇和0. 5%乙酸再次固定5~8min ;③用0. 2% AgNO3染色10~15min ;④用蒸餾水 沖洗數(shù)秒；⑤用I. 5% NaOH和0. 5%甲醛顯色。
[0027] 作為優(yōu)選，1、0數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為字母的規(guī)則為：①有2個(gè)位點(diǎn)，按位點(diǎn)的大小只有第一 個(gè)位點(diǎn)的編碼為A ;只有第二個(gè)位點(diǎn)的編碼為B ;兩個(gè)位點(diǎn)都有的編碼為C ;兩個(gè)位點(diǎn)都沒 的有編碼為N ;②有3個(gè)位點(diǎn)，只有1個(gè)位點(diǎn)的按大小依次編碼為A、B、C ;只有2個(gè)位點(diǎn)的， 按位點(diǎn)組合依次編碼為D、E、F ;三個(gè)位點(diǎn)都有的編碼為G ;如果三個(gè)位點(diǎn)都沒有編碼為N ; ③有4個(gè)位點(diǎn)，只有1個(gè)位點(diǎn)的按大小依次編碼為A、B、C、D ;只有2個(gè)位點(diǎn)則編碼字母從E 開始，按位點(diǎn)組合依次編碼為E、F、G、H、I、J ;只有3個(gè)位點(diǎn)的按位點(diǎn)組合從K開始依次編 碼為K、L ;4個(gè)位點(diǎn)都有的編碼為M，4個(gè)位點(diǎn)都沒有的編碼為N。
[0028] 從以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明利用分子標(biāo)記技術(shù)，通過基因組DNA提取、標(biāo)記篩 選、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物分析、條帶數(shù)據(jù)讀取和字母條形碼的建立等技術(shù)組合，建立了一種DNA條 形碼鑒別茶樹品種的方法，該方法與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法相比，不受環(huán)境條件影響，方法簡 單、快速、準(zhǔn)確，可對茶樹品種的真實(shí)性進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。
【附圖說明】
[0029] 圖1是引物234的擴(kuò)增結(jié)果圖。
[0030] 圖2是引物685的擴(kuò)增結(jié)果圖。
[0031] 圖3是引物A58的擴(kuò)增結(jié)果圖。
[0032] 圖4是引物A142的擴(kuò)增結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合附圖詳細(xì)介紹本發(fā)明：
[0034] 本發(fā)明用櫧葉齊、湘波綠2號(hào)、福鼎大白茶、玉綠和尖波黃13號(hào)共5個(gè)品種來做測 試樣品。首先，DNA提取方法按照試劑盒提供的步驟進(jìn)行，最后溶解DNA到IOOul。Nanodrop 檢測DNA濃度，DNA的濃度用重蒸水稀釋到10-20ng/ul的濃度。
[0035] 接著，篩選條帶清晰、穩(wěn)定且重復(fù)性好的4對SSR引物，具體引物信息如下表1。
[0037] 表1篩選的引物信息
[0038] 然后，按照表2的試劑配方，先將除DNA之外的其它6種試劑進(jìn)行混合，混合時(shí)Taq polymerase最后加入，然后分裝成5份分別加入20ulPCR試管中，最后在每個(gè)管試中分別加 入 lulDNA。
[0041] 表2 IOuIPCR反應(yīng)體系試劑配方
[0042] 將上述試管置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)展，擴(kuò)展程序?yàn)椋?4°C變性3min，94°C變性30s， 53°C退火30s，72°C延伸50s，共30個(gè)循環(huán)，完成以上循環(huán)以后，72°C延伸lOmin，最后將PCR 產(chǎn)物冷卻到室溫或者4°C。從PCR儀取出以后進(jìn)行分析。產(chǎn)物的分析為聚丙烯酰胺凝膠電 泳：移取4ul的PCR產(chǎn)物混合Iul 6 X loading