人類ugt1a1基因多態(tài)性檢測特異性引物和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及一種人類UGTlAl基因多態(tài)性檢測特異性 引物和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 伊立替康（iritinotecan，CPT-11)為喜樹堿類前體藥物，是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑 制劑，可誘導(dǎo)DNA損傷，引起DNA雙鏈斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。大規(guī)模的臨床試驗表明，伊立替 康是治療晚期/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的有效藥物，對氟尿嘧啶耐藥病例亦有效。目前，該藥已被 美國FDA批準(zhǔn)為用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌一線治療的化療藥物。伊立替康在體內(nèi)可經(jīng)羧酸酯酶 代謝成活性成分7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38)，SN-38經(jīng)肝臟尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸 基轉(zhuǎn)移酶（UGTlAl)滅活，從而保護(hù)正常細(xì)胞免受伊立替康毒性的影響。伊立替康最主要的 毒副作用為中性粒細(xì)胞減少和遲發(fā)性腹瀉。臨床研宄表明，40%以上接受伊立替康治療的 患者出現(xiàn)3-4級遲發(fā)性腹瀉，約10%患者出現(xiàn)嗜中性白細(xì)胞減少癥，導(dǎo)致化療提前中止。
[0003] 人類UGTlAl基因多態(tài)性可預(yù)測伊立替康的毒性，啟動子區(qū)域TATA盒的突變 A (TA) 7TAA (UGT1A1*28)可導(dǎo)致UGTlAl酶活性的下降，這種突變在不同種族的突變頻 率不同，白種人中等位基因頻率約為40%，非洲人為48%，日本人為15%。與野生型 UGTlAl [A (TA) 6TAA，6/6]相比，突變型雜合子UGTlAl (6/7)滅活SN-38能力稍低，而突變型 純合子[A (TA) 7TAA，7/7]滅活SN-38的能力僅為野生型的35 %，因此更容易產(chǎn)生毒副作用。 野生型在接受伊立替康治療時產(chǎn)生毒副作用的風(fēng)險較低，而雜合子產(chǎn)生毒副作用的幾率 為12. 5%，突變型純合子則有50%產(chǎn)生毒副作用的可能性。因此，2005年美國FDA要求輝 瑞在伊立替康藥品標(biāo)簽上加入警示，建議患者在使用伊立替康前檢測是否帶有UGT1A1*28 突變。此外，多個亞洲人群的臨床研宄結(jié)果顯示，UGTlAl基因211G>A突變（UGT1A1*6， Gly71Arg)與伊立替康的毒副作用風(fēng)險增加顯著相關(guān)，該突變在亞洲人群中的發(fā)生頻率為 13%~23%。UGTlAl基因多態(tài)性如表1所示。
[0004] 表 1
[0005]
[0006] 針對基因多態(tài)性的檢測方法很多，如直接測序法，焦磷酸測序法，高分辨率溶解曲 線檢測法（High Resolution Melting Analysis，HRM)，焚光定量PCR法等。其中最常見方 法為測序法，該方法費用較低，但操作耗時長且靈敏度低；高分辨率溶解曲線法對設(shè)備要求 比較特殊，在臨床推廣存在一定的困難；傳統(tǒng)熒光定量PCR法在臨床上應(yīng)用較為廣泛，但該 方法檢測基因多態(tài)性一般采用Genotyping方法進(jìn)行檢測，該方法對樣本數(shù)量以及多態(tài)性 分布有一定要求，樣本量少時不能對樣本基因多態(tài)性進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。因此，需要建立一種快 速有效的檢測少量樣本的UGTlAl基因多態(tài)性的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明實施例的目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種人類UGTlAl基因多 態(tài)性的檢測引物和試劑盒，以此解決現(xiàn)有基因多態(tài)性檢測技術(shù)中，樣本量少時基因多態(tài)性 檢測效果不理想的問題。
[0008] 本發(fā)明提供了一種人類UGTlAl基因多態(tài)性檢測特異性引物，其中，所述引物的核 苷酸序列分別為 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2與 SEQ ID N0:3;SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5與 SEQ ID NO:6。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種人類UGTlAl基因多態(tài)性檢測試劑盒，其中，所述試劑盒含有 本發(fā)明所提供的特異性引物。
[0010] 所述試劑盒還包括2組特異性探針序列，其中第1組特異性探針序列的核苷酸序 列如SEQ ID NO:7與SEQ ID NO:8所示，第2組特異性探針序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 9與SEQ ID NO: 10所示，且所述熒光定量PCR探針的5'端有FAM或VIC修飾，3'端有 NFQ-MGB 修飾。
[0011] 本發(fā)明所提供的人類UGTlAl基因多態(tài)性檢測試劑盒采用Taqman探針法，建立了 在同一反應(yīng)管檢測同一基因兩種不同多態(tài)性的多重?zé)晒舛縋CR檢測方法，本發(fā)明UGTlAl 基因多態(tài)性檢測試劑盒采用ARMS引物特異性擴(kuò)增目的模板結(jié)合SNP探針特異性檢測目的 模板的方法，對特異性檢測同一基因兩種多態(tài)性提供雙重保證，同時引入內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)和UNG 酶防污染系統(tǒng)，能更加準(zhǔn)確、穩(wěn)定地對樣品進(jìn)行分型檢測。本發(fā)明的試劑盒具有以下優(yōu)點： 1.可以準(zhǔn)確檢測單個樣品的基因型；2.可以準(zhǔn)確檢測Ing基因組DNA的基因型；3.針對 UGTlAl的基因型設(shè)計ARMS引物和SNP分型探針，可以特異性擴(kuò)增識別對應(yīng)基因的多態(tài)性； 4.使用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，檢測過程均為閉管反應(yīng)，顯著降低污染，并且加入UNG 酶防污染系統(tǒng)，確保結(jié)果真實可信；5.在同一反應(yīng)管中檢測同一基因兩種多態(tài)性，操作簡 便，能在90分鐘內(nèi)完成檢測，且結(jié)果判讀方法簡單客觀，便于分析。
【附圖說明】
[0012] 圖1為UGT1A1*6G/G純合野生樣本32例檢測結(jié)果；
[0013] 圖2為UGT1A1*6G/A雜合突變樣本7例檢測結(jié)果；
[0014] 圖3為UGT1A1*6A/A純合突變樣本1例檢測結(jié)果；
[0015] 圖4為呢1'認(rèn)1*28〇^)6八14)6純合野生樣本30例檢測結(jié)果；
[0016] 圖5為呢1'認(rèn)1*28〇^)6八了4)7雜合突變樣本9例檢測結(jié)果；
[0017] 圖6為呢1'認(rèn)1*28〇^)7八了4)7純合突變樣本1例檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0018] 為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合 附圖及實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施僅僅用以 解釋本發(fā)明，并不限定本發(fā)明。
[0019] 本發(fā)明的一個方面提供了一種人類UGTlAl基因多態(tài)性檢測特異性引物，其中，所 述引物的核苷酸序列分別為 SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2 與 SEQ ID NO:3;SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5 與 SEQ ID NO:6。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種用于人類UGTlAl基因多態(tài)性檢測試劑盒，其中，所述試劑盒 含有本發(fā)明所提供的特異性引物，該試劑盒還包括PCR緩沖液，特異性探針和內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)，Hot Start Taq 酶，UNG 酶。
[0021] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述PCR緩沖液中含有I. 0~5. OmM的MgCl2,1. 0~ 5. OmM 的 dNTPs，即 dATP、dUTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 0 ~5. OmM。
[0022] 其中，所述2組特異性引物序列為SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2與SEQ ID N0:3 ;SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 與 SEQ ID N0:6;其中 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO: 5為普通PCR引物，分別擴(kuò)增包含UGT1A1*6和UGT1A1*28基因多態(tài)性的DNA片段；其 中SEQ ID NO: 3與SEQ ID NO: 6為ARMS引物，用于分別特異性擴(kuò)增含有UGT1A1*6A密碼子 AGA與UGT1A1*28(TA)7啟動子區(qū)A(TA)7TAA的DNA片段。2條ARMS引物分別在3'堿基與 待擴(kuò)增類型模板的堿基配對，同時在其3'末端倒數(shù)第2-3位增加一個或者兩個堿基錯配， 以增強(qiáng)特異性。
[0023] 各引物序列列舉如下：
[0024] UGT1A1*6 上游引物 5' -GCACCTGACGCCTCGT-3' SEQ ID NO: 1
[0025] UGT1A1*6 下游引物 5' -CCTTTGGAATGGCACAG-3' SEQ ID N0:2
[0026] UGT1A1*6ARMS 引物 5' -CTTCAAGGTGTAAAATGCGCT-3' SEQ ID N0:3
[0027] UGT1A1*28 上游引物 5' -CCCTGCTACCTTTGTGGACTG-3' SEQ ID N0:4
[0028] UGT1A1*28 下游引物 5' -GCCTTTGCTCCTGCCAG-3' SEQ ID N0:5
[0029] UGT1A1*28ARMS 引物 5' -TTGGTTTTTGCCATATATATATATATATACG-3' SEQ ID N0:6
[0030] 在本發(fā)明所提供的試劑盒中，可選的，所述特異性探針5'端修飾有FAM或VIC，3' 端修飾有非焚光淬滅基團(tuán)NFQ (Non-Fluorescent Quencher)，該基團(tuán)本身不產(chǎn)生焚光，因此 可以大大降低本底信號的強(qiáng)度，同時該特異性探針上還連接有MGB修飾基團(tuán)，可以將該探 針的Tm值提高10°C左右，因此同樣的Tm值，MGB探針可以比普通Taqman探針設(shè)計的更短， 使得探針在識別具有單個核苷酸多態(tài)性位點時，特異性更強(qiáng)。
[0031] 優(yōu)選地，所述2組特異性探針的核苷酸序列分別為SEQ ID NO:7與SEQ ID NO:8， SEQ ID NO: 9與SEQ ID NO: 10,且其中SEQ ID NO: 7與SEQ ID NO: 8探針分別特異性檢 測 UGT1A1*6G、UGT1A1*6A 模板 DNA，SEQ ID N0:9 與 SEQ ID NO: 10 探針分別特異性檢測 UGT1A1*28 (TA) 6、UGT1A1*28 (TA) 7 模板 DNA ;
[0032] 各探針序列列舉如下：
[0033] UGT1A1*6G 檢測探針 5' -FAM-ATCAGAGACGGAGC-NFQ-MGB-3' SEQ ID N0:7
[0034] UGT1A1*6A 檢測探針 5' -VIC-ATCAGAGACAGAGC-NFQ-MGB-3' SEQ ID N0:8
[0035] UGT1A1*28 (TA) 6 檢測探針 5 ' -FAM-CTCCTACTTATATATATATATATGG-NFQ-MGB-3 ' SEQ ID NO:9
[0036] UGT1A1*28 (TA) 7 檢測探針 5' -VIC-TCCTACTTATATATATATATATATG-NFQ-MGB-3' SEQ ID NO:10
[0037] 在本發(fā)明的【具體實施方式】中，由于待檢測的樣品中的某些成分可能導(dǎo)致PCR出現(xiàn) 部分或完全抑制，故使用內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)監(jiān)測該熒光定量PCR反應(yīng)是否存在抑制；此外，擴(kuò)增儀可 能存在高于允許范圍的孔間差，導(dǎo)致不同管間擴(kuò)增效率差異；另外人為加樣錯誤也可能導(dǎo) 致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，因此本發(fā)明實施例中采用內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)來消除上述隱患，保證了檢測結(jié) 果的準(zhǔn)確性。該內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)優(yōu)選包含內(nèi)標(biāo)引物和內(nèi)標(biāo)探針，本發(fā)明實施例中也可采用本領(lǐng)域 技術(shù)人員熟知的其它內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)。
[0038] 優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)包含內(nèi)標(biāo)引物和內(nèi)標(biāo)探針。所述內(nèi)標(biāo)引物的序列為SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12,所述內(nèi)標(biāo)探針序列為SEQ ID NO: 13,所述內(nèi)標(biāo)探針5'端修飾有 R0X，3'端修飾有BHQ2。
[0039] 優(yōu)選地，本發(fā)明實施例中的內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)針對人類基因組設(shè)計，其中包含的內(nèi)標(biāo)引物 序列如下所示：
[0040] 內(nèi)標(biāo)正向引物 F:5' -CGCAATACCTCCGGATT-3' SEQ ID N0:11
[0041] 內(nèi)標(biāo)反向引物 R:5' -TCCGCAGAGGCACTGAG-3' SEQ ID N0:12
[0042] 本發(fā)明實施例中的內(nèi)標(biāo)探針Y端標(biāo)記有報告基團(tuán)R0X，3^端標(biāo)記有不發(fā)光熒 光淬滅基團(tuán)BHQ2。當(dāng)探針完整的時候，報告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器 檢測不到信號。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在DNA鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其 5' -3'外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團(tuán)遠(yuǎn)離熒光淬滅基團(tuán)，產(chǎn)生熒光信號。因 此檢測到的信號強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。
[0043] 優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)探針為：
[0044] ROX-5' -GGTCGCTGCATGGCTG-3' -BHQ2 SEQ