利用密碼子隨機(jī)化和誘變來合成基因文庫(kù)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開涉及一種容易地合成并分析具有蛋白遺傳突變的基因文庫(kù)和序列文庫(kù)的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 通常，基因合成是指合成長(zhǎng)核酸片段的技術(shù)，其長(zhǎng)度為200堿基對(duì)（bp)以上，包含 來自作為短核酸片段的寡核苷酸的遺傳信息。為此，用于基因合成、寡核苷酸合成和使用寡 核苷酸的基因組裝技術(shù)中的寡核苷酸的設(shè)計(jì)軟件是必要的。作為常見的寡核苷酸合成方 法，有固相寡核苷酸合成法和使用DNA微陣列的寡核苷酸合成法。組裝寡核苷酸的方法可 以大體分為三類方法，即，組裝PCR，融合PCR，和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LCR)及隨后的融合PCR。 合成的基因必須經(jīng)過序列驗(yàn)證，以發(fā)現(xiàn)由寡核苷酸的合成和組裝引起的錯(cuò)誤，從而僅選擇 出具有正確遺傳信息的核酸片段。
[0003] 常規(guī)的基因合成一直是通過以下方式進(jìn)行：將基因的正確核酸堿基序列分割 為多個(gè)短寡核苷酸以合成該基因，在將分割的寡核苷酸組裝后，通過Sanger測(cè)序進(jìn)行 評(píng)估，從而選擇性地獲取具有正確的核酸堿基序列的基因 （Mol Biosyst. 2009年7月； 5(7):714-22.doi:10.1039/b822268c.Epub 2009 年4月 6 日）。然而，盡管開發(fā)了多種組 裝技術(shù)，這種方法因缺乏適當(dāng)?shù)臏y(cè)序技術(shù)而具有局限性。近來，由于開發(fā)出了多種下一代測(cè) 序技術(shù)（例如，諸如Illumina技術(shù)或Ion Torrent技術(shù)以及454技術(shù)等多種技術(shù)），所處 理的序列信息量呈指數(shù)增長(zhǎng)，而分析成本也在逐漸降低（Carr, P. A.和Church, G. M. (2009) Genome engineering. Nat. Biotechnol.，27, 1151-1162)。雖然短寡核苷酸的高通量驗(yàn)證因 下一代測(cè)序（NGS)方法的開發(fā)而變得可能，但是在合成完成后的最終評(píng)估步驟中的有效應(yīng) 用卻不可能，這是因?yàn)橄乱淮鷾y(cè)序所固有的閱讀長(zhǎng)度短的局限性。由于下一代測(cè)序具有單 批次中能夠分析的核酸堿基序列的閱讀長(zhǎng)度短的缺點(diǎn)，所以合成的基因要經(jīng)歷隨機(jī)片段化 或隨機(jī)剪切過程，在該過程中，合成的基因再次被分割為短片段，并使用下一代測(cè)序儀來啟 動(dòng)對(duì)所得基因的分析。隨后，分析來自下一代測(cè)序儀的序列，而后通過計(jì)算機(jī)軟件利用該分 析結(jié)果將DNA片段組裝成整個(gè)基因序列。這種過程的局限性在于，難以判斷在基因合成和 核酸測(cè)序過程中出現(xiàn)的錯(cuò)誤來自那些片段。此外，當(dāng)所合成的基因的長(zhǎng)度并不長(zhǎng)且所分析 的基因文庫(kù)種類較小時(shí)，使用下一代測(cè)序來分析所合成的基因的方法并不是經(jīng)濟(jì)的方法。 因此，下一代測(cè)序在基因合成中的應(yīng)用極其有限。
[0004] 在蛋白工程或生物合成途徑工程中，大致理解蛋白的表型與基因型之間的關(guān)聯(lián)是 非常重要的研宄課題。實(shí)際上，在構(gòu)建了啟動(dòng)子（Patwardhan RP, Lee C, Litvin 0, Young DL，Pe，er D，Shendure J.Nature Biotechnology, 27, 1173-1175(2009))、短肽（Whitehead TA, Chevalier A, Song Y, Dreyfus C, Fleishman SJ, De Mattos C, Myers CA, Kamisetty H，Blair P，Wilson IA，Baker D. Nature Biotechnology, 30, 543-548 (2012))、單鏈抗體 的互補(bǔ)決定區(qū)（DeKosky BJ，Ippolito GC，Deschner RP，Lavinder JJ，Wine Y, Rawlings BM,Varadarajan N,Giesecke C,Dorner T,Andrews SF,Wilson PC,Hunicke-Smith SP, Willson CG1Ellington AD1Georgiou G. Nature Biotechnology, 31, 166-169(2013), L arman HB,Xu GJ,Pavlova NN,Elledge SJ.PNAS, 109, 18523-18528(2012))之后，一直在持 續(xù)進(jìn)行研宄以確定這些構(gòu)建的序列中表型與基因型之間的關(guān)聯(lián)。然而，由于下一代測(cè)序中 的閱讀長(zhǎng)度短，這些研宄通常并不以蛋白的完整區(qū)域?yàn)槟繕?biāo)，而是會(huì)構(gòu)建比閱讀長(zhǎng)度短的 結(jié)構(gòu)域區(qū)域。為了構(gòu)建蛋白的完整區(qū)域，必須通過Sanger測(cè)序來對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，或者必 須重新組裝下一代測(cè)序信息（短的讀出序列）。前一種情況效率很低，因?yàn)槠浜臅r(shí)且費(fèi)力， 還需要較高的成本。后一種情況受到目前已知的方法的阻礙。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] [技術(shù)問題]
[0006] 因此，本公開針對(duì)上述問題而完成，本公開的目的是提供一種通過解決下一代測(cè) 序的局限性而合成基因并構(gòu)建蛋白的完整區(qū)域的方法。
[0007] [技術(shù)方案]
[0008] 根據(jù)本公開的第一方面，上述目的和其他目的可以通過提供一種合成第二基因文 庫(kù)的方法來實(shí)現(xiàn)，所述方法包括：(a)提供包含隨機(jī)化的密碼子的第一基因文庫(kù)，其編碼特 定蛋白序列但具有不同的核酸堿基序列；(b)將第一基因文庫(kù)片段化為核酸片段；（C)確認(rèn) 所述核酸片段的堿基序列；和（d)使用密碼子隨機(jī)化的堿基序列，將堿基序列經(jīng)確認(rèn)的核 酸片段重新組裝成片段化前的基因序列。
[0009] 根據(jù)本公開的另一方面，提供了一種用上述方法制造的無(wú)錯(cuò)的基因文庫(kù)，其包含 編碼相同蛋白但具有不同喊基序列的基因。
[0010] 根據(jù)本公開的另一方面，提供了一種合成突變基因的文庫(kù)的方法，所述方法包括： (a)提供包含隨機(jī)化的密碼子的基因文庫(kù)，其編碼特定蛋白序列但具有不同的核酸堿基序 列；(b)誘導(dǎo)所述基因文庫(kù)發(fā)生突變；(c)將突變基因的文庫(kù)片段化為核酸片段；（d)確認(rèn) 所述核酸片段的堿基序列；和（e)使用密碼子隨機(jī)化的堿基序列，將堿基序列經(jīng)確認(rèn)的核 酸片段重新組裝成片段化前的基因序列。
[0011] 根據(jù)本公開的另一方面，提供了一種用上述合成突變基因文庫(kù)的方法制造的突變 基因文庫(kù)。
[0012] 根據(jù)本公開的另一方面，提供了一種從上述突變基因文庫(kù)中選擇性地?cái)U(kuò)增所需的 基因序列的方法。
[0013] [有益效果]
[0014] 根據(jù)本公開內(nèi)容，當(dāng)通過基因片段化來進(jìn)行下一代測(cè)序時(shí)，原始基因序列可以通 過用重疊共有序列法組裝NGS讀出序列而得到正確復(fù)原。由此，下一代測(cè)序在應(yīng)用于基因 合成時(shí)的局限性（閱讀長(zhǎng)度短）可以得到解決。此外，可以在單批中制造包含相同蛋白信 息和不同DNA序列的數(shù)百至數(shù)千種不同的基因文庫(kù)（同義基因文庫(kù)），且所有的基因序列都 可以通過一次測(cè)序來得到確認(rèn)。當(dāng)將這種基因文庫(kù)合成和分析方法與蛋白工程法組合時(shí)， 構(gòu)建蛋白的完整區(qū)域（這在常規(guī)方法中是不可能的）變得可能。
【附圖說明】
[0015] 通過下文結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明的上述的和其他的目標(biāo)、特征和優(yōu)點(diǎn)將得 到更加清楚的理解，在附圖中：
[0016] 圖1是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的合成基因文庫(kù)的方法的流程圖；
[0017] 圖2是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的利用目標(biāo)基因的蛋白序列推導(dǎo)出具有隨機(jī) 化密碼子的DNA序列的過程的圖；
[0018] 圖3是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的用來合成基因文庫(kù)的寡核苷酸設(shè)計(jì)的圖；
[0019] 圖4是說明按照本公開的一個(gè)實(shí)施方式用限制性酶除去質(zhì)粒主干并進(jìn)行下一代 測(cè)序的不意圖；
[0020] 圖5是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的重新組裝通過下一代測(cè)序測(cè)得的核酸片段 的方法的示意圖；
[0021] 圖6是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的kanR基因文庫(kù)的合成結(jié)果的圖；
[0022] 圖7是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的在使用大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)控制基因文庫(kù) 大小的示意圖；
[0023] 圖8是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的使用超聲發(fā)生器進(jìn)行隨機(jī)片段化的條件和 結(jié)果的圖；
[0024] 圖9是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的在片段化后為下一代測(cè)序做準(zhǔn)備的過程的 圖；
[0025] 圖10是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的kanR基因文庫(kù)的分析結(jié)果的圖；
[0026] 圖11是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的針對(duì)kanR基因文庫(kù)的選擇性復(fù)原實(shí)驗(yàn)的結(jié) 果的圖；
[0027] 圖12是說明按照本公開的一個(gè)實(shí)施方式使用pUC19質(zhì)粒制備pUCN質(zhì)粒的圖；
[0028] 圖13是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的tolC基因文庫(kù)的合成結(jié)果的圖；
[0029] 圖14是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的使用Npu內(nèi)含肽的初步實(shí)驗(yàn)過程的圖；
[0030] 圖15是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的對(duì)使用Npu內(nèi)含肽的實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果的 圖；
[0031] 圖16是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的對(duì)使用Npu內(nèi)含肽的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的模擬結(jié)果 的圖；
[0032] 圖17是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的用于分析突變Npu內(nèi)含肽文庫(kù)的信息匯總 的圖；
[0033] 圖18是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的Npu內(nèi)含肽的高度保守的位置的示意圖；
[0034] 圖19是呈現(xiàn)了本公開的一個(gè)實(shí)施方式的通過趨勢(shì)檢驗(yàn)而計(jì)算出的優(yōu)選突變的 圖；
[0035] 圖20是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的CysErrlOOO庫(kù)的基因型的圖；
[0036] 圖21是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的內(nèi)含肽突變序列根據(jù)外顯肽的類型對(duì)卡那 霉素的耐受程度的圖；
[0037] 圖22是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的在CysErr庫(kù)和SerErr庫(kù)中外顯肽殘基趨 勢(shì)的圖；和
[0038] 圖23是說明本公開的一個(gè)實(shí)施方式的Npu內(nèi)含肽的選擇性復(fù)原實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 本說明書中使用的術(shù)語(yǔ)"核苷酸"是指單鏈或雙鏈的脫氧核糖核酸（DNA)或核糖 核酸（RNA)，除非另有定義，該術(shù)語(yǔ)可以包括核苷酸的類似物。
[0040] 本公開中所用的術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增"是指擴(kuò)增目標(biāo)核酸堿基序列的反應(yīng)，可以使用聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)來進(jìn)行。PCR包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)、多重PCR、實(shí) 時(shí)PCR、組裝PCR、融合PCR和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LCR)。
[0041] 本說明書中使用的術(shù)語(yǔ)"引物"是指寡核苷酸。引物是單鏈的，可以包括核糖核酸， 優(yōu)選是脫氧核糖核酸。引物與模板的一條鏈雜交或退火，由此形成雙鏈結(jié)構(gòu)。引物可以與 本公開的側(cè)翼序列雜交或退火。術(shù)語(yǔ)"退火（annealing)"是指寡核苷酸或核酸與模板核酸 匹配結(jié)合（juxtapose)，通過該匹配結(jié)合，核苷酸通過聚合酶而聚合，因此，形成了與模板核 酸或其一部分互補(bǔ)的核酸分子。術(shù)語(yǔ)"雜交"是指兩條單鏈核酸通過互補(bǔ)序列的配對(duì)而形 成雙鏈結(jié)構(gòu)。在誘導(dǎo)合成與模板互補(bǔ)的引物的延伸產(chǎn)物時(shí)，引物可以起到合成引發(fā)劑的作 用。
[0042] 在本公開中，存在于寡核苷酸末端的5'末端側(cè)翼序列和3'末端側(cè)翼序列是增加 寡核苷酸的量的引發(fā)位置，可以用作引物組的退火位點(diǎn)來產(chǎn)生足量的寡核苷酸，兩端的側(cè) 翼序列均可以存在于限制性酶的識(shí)別序列末端，或可以包含限制性酶的識(shí)別序列。在本公 開的一個(gè)實(shí)施方式中，本公開的側(cè)翼序列可用于擴(kuò)增反應(yīng)中。
[0043] 本公開所用的術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)"是指具有在特定的雜交或退火條件下可以與上述核苷 酸序列選擇性地雜交的互補(bǔ)性。
[0044] 本公開中所用的術(shù)語(yǔ)"組裝"是指利用互補(bǔ)序列將核酸片段對(duì)齊并合并，從而連接 成更長(zhǎng)的核酸片段。
[0045] 本公開中所用的術(shù)語(yǔ)"蛋白工程"是指：在合成具有所需的與野生型蛋白不同的氨 基酸序列的新蛋白后，通過翻譯出各蛋白來研宄各蛋白的多種性質(zhì)，例如結(jié)構(gòu)、功能、互補(bǔ) 性或穩(wěn)定性。蛋白工程是通過人工控制蛋白的結(jié)構(gòu)來制備有用的新蛋白，且包括設(shè)計(jì)蛋白。
[0046] 本公開中所用的術(shù)語(yǔ)"克隆"是指：通過基因操縱技術(shù)將特定基因連接至載體，從 而將該特定基因?qū)胨拗骷?xì)胞，并利用細(xì)胞的復(fù)制機(jī)制進(jìn)行大量增殖。作為增殖方法，可以 用使用源自多種質(zhì)粒或噬菌體的載體DNA的方法。
[0047] 本公開中所用的術(shù)語(yǔ)"質(zhì)粒"是指與細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)染色體分離的DNA，質(zhì)粒可以自 發(fā)地進(jìn)行增殖。質(zhì)粒運(yùn)輸被克隆的基因。<