氘化核糖核苷、n-保護(hù)的亞磷酰胺以及寡核苷酸的合成的制作方法
【專利說明】氘化核糖核苷、N-保護(hù)的亞磷酰胺以及寡核苷酸的合成 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及寡核苷酸以及寡核苷酸合成，并且更具體來說，涉及修飾的RNA、亞磷 酰胺和RNA寡核苷酸，以及用于合成RNA的方法，所述RNA含有供合成修飾的寡核苷酸用的 部分或完全飽和的氘化糖和/或核堿基以及氘化亞磷酰胺。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 本發(fā)明涉及以下的合成：能夠展現(xiàn)出生物化學(xué)上有用且生物學(xué)上有價值的特性、 因此具有潛在治療用途的高純度氘化糖、氘化核堿基、氘化核苷，以及限定序列的氘化RNA。 過去數(shù)十年中，已經(jīng)開發(fā)出許多RNA和DNA序列，其用于治療劑、診斷劑、藥物設(shè)計(jì)、細(xì)胞內(nèi) 環(huán)境中RNA序列的選擇性抑制，以及阻斷細(xì)胞內(nèi)存在的不同類型的RNA的功能。一種方法 是使用反義技術(shù)。反義寡核苷酸可用于在哺乳動物細(xì)胞中特異性地抑制不當(dāng)基因表達(dá)。反 義寡核苷酸可用于雜交并且通過活化RNA酶H而抑制RNA、典型地信使RNA的功能。首先， 寡核苷酸通過活化RNA酶H影響靶RNA的水平，所述RNA酶H裂解DNA/RNA雜合體的RNA 鏈。因此，已提議反義寡核苷酸用于治療疾病。盡管所述技術(shù)有潛力成為用于所有疾病的 強(qiáng)大工具，但包括分子穩(wěn)定性在內(nèi)的數(shù)個問題阻礙了所述技術(shù)成為主要疾病對抗療法。
[0004] 另一方法聚焦于使用基于核酸的分子使基因表達(dá)在mRNA水平沉默。RNA干擾 (RNAi)提供選擇性基因抑制的更大潛力，并且提供控制和管理各種生物化學(xué)以及藥理學(xué) 過程的更大希望。早期研宄說明秀麗隱桿線蟲（C.elegans)中的RNA干擾是由21和22 個核苷酸的RNA介導(dǎo)，參見Fire等，Nature，391，806-811，1998。這由說明以下的研宄 進(jìn)一步證實(shí)：通過小的雙鏈RNA特異性抑制基因表達(dá)的一般現(xiàn)象是由21和22個核苷酸 的RNA介導(dǎo)（Genes Dev.，15，188-200,2001)。同時進(jìn)行的研宄證實(shí)通過小的雙鏈（dS) RNA對特異性基因表達(dá)所致的所述現(xiàn)象在無脊椎動物和脊椎動物中是相似的。各種研 宄已說明RNAi可用作選擇性和特異性基因抑制和調(diào)控的強(qiáng)大工具，參見Nishikura，K.， Cell，107,415-418, 2001 ;Nykanen 等，Cell，107,309-321，2001 ;Tuschl，T.，Nat. Biotechnol.，20, 446-448, 2002 ;Mittal，V.，Nature Rev.，5, 355-365, 2004 ;Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 6047-6052, 2002 ；Donze, 0. &Picard, D. , Nucl. Acids. Res.，30, e46, 2002 ;Sui，G 等，Natl. Acad. Sci. USA，99,5515-5520, 2002 ;Paddison，等， Genes Dev. ，16,948_959,2002。
[0005] 除了使用天然雙鏈（ds)RNA序列，化學(xué)修飾的RNA已示出在用于siRNA活性的序 列中使用2' -脫氧-2' -氟-D-阿糖核酸（FANA)而在哺乳動物細(xì)胞中引起類似的或增 高的 RNA 干擾，參見 Dowler 等，Nucl. Acids Res.，34,1669-1675, 2006。已尋求改進(jìn) SiRNA 特性的各種其他修飾，包括改變骨架化學(xué)、2'-糖修飾、核堿基修飾，參見Nawrot，B等，Med. Chem.，6, 913-925, 2006 以及 Manoharan，M.Curr.Opin.Chem. Biol.，8, 570-579, 2004 的綜 述。盡管已容許SiRNA的修飾，但數(shù)個研宄指示毒性增大且功效降低，參見Harborth，等， Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，13,83_105,2003。Chiu 等證明盡管 2'-〇-甲基修 飾維持A形式的RNA樣螺旋，但確實(shí)保留了 SiRNA活性，或在一些情況下，降低了 SiRNA活 性，這取決于序列內(nèi)所述修飾的數(shù)量，參見RNA，9,1034-1048, 2003。還已示出可在有義鏈中 對序列進(jìn)行廣泛2' -0甲基修飾，而不損失SiRNA活性，參見Kraynack, B. A.，Baker, B. F.， RNA，12,163-176,2006。已將賦予高結(jié)合親和力的雙環(huán)鎖定核酸（LNA)引入SiRNA序列，尤 其是在避免SiRNA序列的中心區(qū)的情況下，參見Braash等，Biochemistry，42,7967_7995， 2003。類似地，已示出含有剛性構(gòu)象的阿卓糖醇糖修飾的寡核苷酸（ANA)以一種序列特異 性方式與RNA形成可降解的雙鏈體。另外，ANA已示出保留A (RNA類型）構(gòu)象。Fisher, M. 等，Nucl. Acids Res.，35,1064-1074,2007證明與未修飾的對照相比，靶向MDR1基因的ANA 修飾的siRNA展現(xiàn)出改善的功效、在修飾接近有義或反義鏈的3'端時尤其有效。
[0006] 數(shù)個研宄已指示SiRNA通過各種遞送系統(tǒng)吸收的潛力。所述遞送系統(tǒng)然后可在治 療劑的開發(fā)中利用。膽固醇綴合的siRNA可實(shí)現(xiàn)遞送到細(xì)胞中并且使基因表達(dá)沉默。另 外，脂質(zhì)綴合的siRNA、膽汁酸以及長鏈脂肪酸可介導(dǎo)siRNA吸收到細(xì)胞中并且體內(nèi)使基因 表達(dá)沉默。siRNA綴合物在組織中的有效且選擇性吸收取決于與脂蛋白顆粒的最大締合性、 脂蛋白/受體相互作用以及跨膜蛋白介導(dǎo)的吸收。高密度脂蛋白將siRNA的遞送導(dǎo)向到肝 臟、腸管、腎臟以及含有留類的器官中。此外，LDL將siRNA主要導(dǎo)向到肝臟中。研宄指示 LDL受體涉及在siRNA的遞送中。因此，已提議siRNA可經(jīng)設(shè)計(jì)具有化學(xué)修飾以便保護(hù)免 于核酸酶降解、消除炎癥、降低脫靶基因沉默，并且從而提高對靶基因的有效性。脂質(zhì)和允 許增高的細(xì)胞吸收的其他親脂性分子的遞送媒介物或綴合物對于治療開發(fā)是必需的。所述 siRNA目前正開發(fā)用于人類靶標(biāo)驗(yàn)證，并干擾疾病途徑且開發(fā)新的領(lǐng)域用于藥物開發(fā)。
[0007] siRNA的有義鏈的3'端可被修飾，并且在此端附接配體是最合適的，參見例如 Ya-Lin Chiu 和 Tariq Rana，RNA，9,1034-1048,2003 ;M.Manoharan，Curr.0pin.Chem. Biol，6, 570-579, 2004 ;Nawrot，B?和 Sipa，K.，Curr. Top. Med. Chem.，6,913-925,2006; Scaringe，S?等，Biotechnol.，22, 326-30, 2004。親脂性或疏水性基團(tuán)的引入和siRNA遞送 的增高以及靶標(biāo)的最優(yōu)化已通過生物綴合解決并實(shí)現(xiàn)。通常，附接在有義鏈的3'端進(jìn)行， 但可在反義鏈的3'端進(jìn)行。核酸酶抗性siRNA的設(shè)計(jì)曾為嘗試開發(fā)有效治療劑的深入研 宄和開發(fā)的主題。因此，堿基修飾如2-硫代尿苷、假尿苷以及二氫尿苷已說明了對RNA分 子的構(gòu)象和相關(guān)聯(lián)的生物活性的作用，參見Sipa等，RNA，13,1301-1316, 2007。Layzer等， RNA，10, 766-771，2004說明2' -修飾的RNA、尤其是2' -氟對核酸酶具有極大的抗性并且 體內(nèi)具有生物活性。Dande等，Med. Chem.，49,1624-1634,2006使用4'-硫代修飾的糖核苷 組合2'-〇烷基修飾來改進(jìn)siRNA特性和RNAi增大。Li等，Biochem. Biophys. Res. Comm.， 329,1026-1030, 2005 和 Hall 等，Nucl. Acids Res.，32, 5991-6000, 2004 說明用 siRNA 的硫 代磷酸酯和硼烷磷酸酯體內(nèi)置換核苷酸間磷酸酯。
[0008]除了核苷的體內(nèi)穩(wěn)定性和適當(dāng)修飾，siRNA分子、RNA分子、適體以及合成DNA分 子的生物綴合要求細(xì)胞膜滲透性的關(guān)鍵特征。不充分的跨膜細(xì)胞吸收限制siRNA、其他單 鏈RNA或甚至各種DNA分子的實(shí)用性。因此，已經(jīng)示出附接在siRNA的3'端的膽固醇改善 體內(nèi)細(xì)胞運(yùn)輸和基因的治療性沉默，參見Soutschek等，Nature，432,173-0178, 2004。除 了膽固醇，已開發(fā)了各種綴合，包括天然和合成蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（PTD)，還稱為細(xì)胞滲透肽 (CPP)或膜永久肽（MPP)。PTD為能夠與質(zhì)膜相互作用的短的氨基酸序列。MPP-siRNA綴 合物的吸收迅速發(fā)生。所述肽可優(yōu)選地綴合至鏈的3'端。PEG(聚乙二醇-寡核苷酸）綴 合物已用于各種綴合復(fù)合物，并且在靶細(xì)胞中吸收后具有顯著的基因沉默作用，參見Oishi 等，.Am. Chem. Soc.，127,1624-1625, 2005。適體已用于siRNA的位點(diǎn)特異性遞送?？紤]到 適體對其靶標(biāo)具有高親和力，siRNA的綴合物充當(dāng)優(yōu)良的遞送系統(tǒng)并且使得有效抑制靶基 因表達(dá)，參見Chu等，Nucl. Acids Res.，34(10)，e73, 2006。這些分子可綴合在siRNA或其 他生物活性寡核苷酸的3'端。在3'端的各種脂質(zhì)綴合可附接至通過本發(fā)明描述的方法合 成的寡核苷酸并且可用于寡核苷酸的有效內(nèi)化。親脂性部分由羥基官能組成，以合成亞磷 酰胺。類似地，親脂性部分可在末端處具有羧酸官能。后者可偶聯(lián)至具有間隔子的3'-氨 基，這通過使用DCC(二環(huán)己基碳二亞胺）或類似的偶聯(lián)劑最后添加反向合成的寡核苷酸 的氨基連接體如C-6氨基連接體亞酰胺至羧酸部分合成，參見Paula等，RNA，13,431-456， 2007〇
[0009] 微小RNA(miRNA)為一大類非編碼RNA，其已示出在基因調(diào)控中起作用，參見 Bartel，D.P. Cell，116,281_297 ;He 等 Nat. Rev. Genet，5:522_531，2004;Lagos-Quintana 等，Science，204:853-858, 2001。據(jù)估計(jì)在整個人基因組中散布有至少1000種miRNA。許多 這些miRNA已示出下調(diào)大量靶mRNA，參見Lim等，Nature，433:769-773，2005。miRNA的不同 組合可涉及在哺乳動物細(xì)胞中靶基因的調(diào)控中。siRNA已經(jīng)示出充當(dāng)miRNA，參見Krek等， Nat. Genet.，37:495-500, 2005 ;Doench 等，Genes Dev.，17:438-442, 2003。微小 RNA 具有極 大潛力在基因調(diào)控中作為治療劑，Hammond, S.M.，Trends Mol. Med. 12:99-101，2006。當(dāng)前 大量努力正致力于了解miRNA途徑、其在發(fā)育和疾病中的作用以及其在癌癥中的作用。另 外，正開發(fā)miRNA靶標(biāo)用于治療和診斷開發(fā)。鑒別出大量miRNA，并且通過微測定、PCR和信 息學(xué)確定其作用。設(shè)計(jì)來祀向miRNA的RNA的合成還要求RNA合成和類似的修飾，如對于 SiRNA所要求的，以穩(wěn)定RNA和生物綴合，從而產(chǎn)生較好的細(xì)胞吸收。本發(fā)明將極大地加速 這一研宄和開發(fā)的步伐。
[0010] 治療等級的RNA、反義RNA或siRNA的合成要求寡核苷酸的3'端的修飾或標(biāo)記。 在siRNA情況下，通常為有義鏈的3'端。使用3'至5'合成法，要求親脂性、長鏈配體或發(fā) 色團(tuán)的3'端修飾的RNA的合成具有挑戰(zhàn)性，并且要求對應(yīng)的固體載體。所述合成通常導(dǎo)致 低的偶聯(lián)效率和總體上較低的最終寡核苷酸純度，這是因?yàn)榇罅拷囟绦蛄泻兴璧氖杷?性修飾。本發(fā)明的作者通過開發(fā)反向RNA單體亞磷酰胺用于在5'至3'方向上進(jìn)行RNA合 成解決了這一問題。這一方法產(chǎn)生極清潔的寡核苷酸合成，因此允許在3'端清潔且有效地 引入各種修飾。
[0011] 為增大穩(wěn)定性，已合成含有脂質(zhì)的寡核苷酸。附接脂質(zhì)提供RNA的有效遞送 和寡核苷酸的細(xì)胞濃度的增大。疏水性分子如膽固醇可結(jié)合LDL顆粒和脂蛋白以便活 化涉及這些蛋白質(zhì)的遞送過程，從而運(yùn)送寡核苷酸。脂質(zhì)化的核酸還可降低寡核苷酸 的親水性。還示出脂質(zhì)性核酸改善寡核苷酸的功效，參見Shea等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,6553,1989 ;0berhauser，B?和 Wagner，E.，Nucleic Acids Res.，20,533， 1992 ;Saison，_Behmoaras 等.The EMBOJournal，10,1111，1991 ;Reed 等，Bioconjugate Chem.，2,217，1991 ;Polushin 等，Nucleosides&Nucleotides，12,853，1993 ;Marasco 等， Tetrahedron Lett.，35, 3029,1994。將一系列疏水性基團(tuán)如金剛燒、二十碳稀酸、膽固醇以 及二（十六烷基）二醇在3'端附接至寡脫氧核苷酸序列并且雜交至互補(bǔ)的RNA序列。發(fā)現(xiàn) Tm未受影響，這指示所述基團(tuán)不干擾寡雜交特性，參見Manoharan等，Tetrahedron Lett.， 36,1995 ;Manoharan 等，Tetrahedron Lett.，36, 3651-3654,1995 ;Gerlt，J. A. Nucleases， 第二版，Linn, S. M.，Lloyd, R. S.，Roberts, R. J.，編? Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 10 頁，1993。
[0012] 為有效遞送合成的RNA分子，PEG附接至各種寡核苷酸已示出有利特性。PEG-寡 聚物已通過防止快速消化而示出酶促穩(wěn)定性。熱熔融行為不受影響，從而保留雙鏈結(jié)構(gòu) (formation)的特性。Srivastava 等，Nucleic Acids SymposiumSeries，2008, 52,103-104 最近開發(fā)了一種反向RNA合成方法，用于將親脂性且大的分子清潔不接至合成的RNA。
[0013] 現(xiàn)有技術(shù)說明
[0014] 已針對許多核苷和寡核苷酸進(jìn)行氘標(biāo)記研宄與NMR分析。DNA和RNA的結(jié)構(gòu)和動 力學(xué)對于了解其生物學(xué)功能是重要的。這通過多種物理化學(xué)技術(shù)來調(diào)研。在這些技術(shù)中， 核磁共振（NMR)光譜法已廣泛用作強(qiáng)大工具，因?yàn)槠涮峁┌凳揪植拷Y(jié)構(gòu)變異的構(gòu)象信息和 一定生物學(xué)條件下的動力學(xué)。這已使用強(qiáng)大計(jì)算機(jī)和高共振能儀器而改進(jìn)。隨著磁場增 大，較高靈敏度降低獲得優(yōu)質(zhì)光譜所需的寡聚物的量，并且增大共振信號的分散，從而降低 由于第二級J耦合至第一級引起的共振重疊所致的光譜復(fù)雜性。進(jìn)行描述將氘并入脫氧 核苷、核糖核苷以及修飾的核苷的特定位置的大多數(shù)研宄，以嘗試通過質(zhì)子核磁共振（NMR) 確定寡核苷的結(jié)構(gòu)以及構(gòu)象細(xì)節(jié)。寡核苷酸的質(zhì)子NMR光譜通常相當(dāng)復(fù)雜并且不揭示出構(gòu) 象與結(jié)構(gòu)信息。由于寡核苷酸具有顯著重疊NMR共振，氣化寡核苷酸的結(jié)構(gòu)確定已用于生 物功能性DNA或RNA分子的NMR結(jié)構(gòu)確定。為克服與共振相關(guān)的問題，研宄人員開發(fā)了非均 一氣標(biāo)記技術(shù)，參見 Foldesi 等，J. Tetrahedron，1992,48,9033 ;Foldesi 等，J.，Biochem. Biophys. Methods，1993, 26。氣標(biāo)記的寡核苷酸簡化了 NMR光譜，從而允許按明確的方式從 大分子的小結(jié)構(gòu)域確定J親合與N0E體積，參見Glemarec等，J. Nucleic Acids Res.，1996， 24,2002 和 Ludwig，J. Acta Biochem.Biophys Acad Sci.，1981，16,131〇
[0015] 類似地，大量寡DNA和RNA的位點(diǎn)特異性氘化已用于通過"NMR窗口"概念研宄NMR 結(jié)構(gòu)，在所述窗口中僅寡核苷酸的小節(jié)段是NMR可見的。使用這種方法來解決以下各物的 NMR結(jié)構(gòu)：21 聚體RNA發(fā)卡環(huán)，參見Nucleic Acids Researchl996 24:1187和Nucleosides and Nucleotides 1997, 5&6, 743 ;和31聚體莖-內(nèi)環(huán)-莖-內(nèi)環(huán)-莖-發(fā)卡環(huán)RNA。非對 映特異性C-2'（寡DNA中氣標(biāo)記的核苷區(qū)段（Journal Tetrahedron，1995,51，10065))成 功用在NMR解釋，降低的自旋擴(kuò)散收集以及噸1'、H2"以及噸1'、H2"耦合常數(shù)的提取中。
[0016] Huang 等，Acids Research，1997,25,4758-4763 示出在寡核苷酸的二維（2D) N0ESY光譜中，如果嘌呤的H-8和嘧啶的H-6被氘置換，那么使核堿基與糖質(zhì)子相關(guān)聯(lián)的整 個交叉峰消失。類似地，研宄人員關(guān)注通過2H NMR研宄蛋白質(zhì)與DNA相互作用動力學(xué)的作 用。固態(tài)2DNMR提供關(guān)于寡核苷酸中各種官能團(tuán)的移動的有價值信息。Chirukul和其共 同工作者示出特異性氣化在確定所述結(jié)構(gòu)特征中起著極其重要的作用，參見Nucleosides， Nucleotides and Nucleic acids，2001，20,1903-1913。
[0017] 代替氫，用氘取代的酶識別或酶促結(jié)合未受到不利影響。特定序列的酶識別是寡 核苷酸關(guān)于其特異性作用的生物化學(xué)相互作用的第一步，并且氘標(biāo)記不會改變位點(diǎn)識別的 生物化學(xué)過程。類似地，已知雙鏈的雜交不受氘標(biāo)記影響，這是由于氘和氫原子半徑對于識 別模式的任何破壞都是極其接近的。
[0018] 預(yù)期代替氫氘在寡核苷酸的糖部分中的多個共價標(biāo)記（碳-氫鍵成為碳-氘鍵） 減緩寡核苷酸的消化速率，寡核苷酸的消化在細(xì)胞環(huán)境中用外切酶和內(nèi)切酶快速發(fā)生。寡 核苷酸的快速消化由寡核苷酸的較短半衰期和從身體的清除得以證明。與DNA分子相比， 這在RNA分子方面是更為顯著的。預(yù)期治療性寡核苷酸的緩慢消化為治療候選物增添了額 外的優(yōu)點(diǎn)，而同時其他物理或化學(xué)特性不受影響。期望氘化核糖寡核苷酸的各種生物化學(xué) 作用，預(yù)期氘化寡聚物減緩寡核苷酸消化成較小的片段，并且不具有關(guān)于氫鍵合、RNA酶H 校正活性或通過RISC復(fù)合物識別的作用。細(xì)胞內(nèi)水解或氘交換可導(dǎo)致氧化氘（D 20)的釋 出。
[0019] 已常規(guī)地進(jìn)行氘交換的酶促法用于氘標(biāo)記。然而，交換法不完全，這是由于酶促反 應(yīng)中存在平衡。期望氘標(biāo)記的寡核苷酸將在細(xì)胞環(huán)境中用氫類似地交換氘，從而導(dǎo)致氧化 氘在細(xì)胞環(huán)境中釋放。由于氧化氘已知為一種營養(yǎng)劑，因此本發(fā)明的寡核苷酸可提供營養(yǎng) 價值。
[0020] 已相當(dāng)廣泛地進(jìn)行使用氘交換用于核苷和寡核苷酸的光譜分配。核堿基殘基的氘 化已描述在質(zhì)子在C8-嘌呤和C5-胞嘧啶處用氘代亞硫酸氫銨在pH 7. 8下在脫氧寡聚物 中進(jìn)行交換中，所述交換導(dǎo)致90-95原子％的屯并入。Brush等，Biochemistry 1988, 27， 115出1~11811等.4111.〇16111.5〇(3.1998，110,4405 描述了在胸苷的05-甲基處在21120中進(jìn)行的 鉑催化的交換。
[0021] 已經(jīng)開發(fā)了多種多樣的酶促和化學(xué)方法來用于在糖與核苷水平二者上并入氘，從 而提供高水平的氘并入0VH比）。氘交換的酶促法通過具有低并入水平并且提供顯著水 平的雜散共振。酶促并入具有另外的復(fù)雜性，這是由于分離氘化單核苷酸區(qū)段所要求的繁 瑣的分離技術(shù)。Schmidt 等，Ann. Chem. 1974,1856 ;Schmidt 等，Chem. Ber.，1968, 101，590 描述了 5'，5 "-2H2-腺苷的合成，其是由2'，3' -0-異亞丙基腺苷-5' -甲酸或甲基-2, 3-異 亞丙基 _0_D_ 核糖呋喃酸糖酸（furanosiduronic acid)制備，Dupre，M?和 Gaudemer，A.， Tetrahedron Lett. 1978, 2783。Kintanar 等，Am. Chem. Soc. 1998,110,6367 報道了可使用 硼氘化鈉或氘化鋁鋰（98原子％的2H并入），通過還原適當(dāng)?shù)?' -醛，獲得5' -氘代腺苷與 5'（R/S)-氣化胸苷的非對映異構(gòu)體混合物。Berger等，Nucleoside&Nucleotides 1987,6， 395描述了通過在2H20/吡啶混合物（1:1)中加熱醛、接著用NaBD 4還原醛將2'脫氧鳥苷的 5' -醛衍生物轉(zhuǎn)化成5'或4' -氘代-2' -脫氧鳥苷。
[0022] Ajmera 等，Labelled Compel. 1986, 23,963 描述了獲得 4'-氣標(biāo)記的尿苷和胸苷 (98 原子％的211)的程序。Sinhababu 等，J. Am. Chem. Soc. 1985，107,7628)證明了在糖合成 過程中，在使用硼氘化鈉立體選擇性還原1，2:5, 6-二-0-異亞丙基-B-D-己呋喃糖-3-酮 水合物成為1，2:5, 6-二-0-異亞丙基-3-氘代-B-D-己呋喃核糖并且隨后進(jìn)一步進(jìn)行核 苷合成時，氘并入在腺苷的C3'（97原子％ 2H)處。Robins等，Org. Chem. 1990, 55,410報 道了在通過硼氘化鈉在乙酸中還原2' -0-叔丁基二甲基甲硅烷基（TBDMS)3-酮核苷時， 以實(shí)際