一種新的豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株gp5重組蛋白及其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株GP5重組蛋白，具體是一種新的 豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株GP5重組蛋白及其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征是PRRSV引起的以妊娠母豬繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥 狀和高死亡率為特征的豬的一種病毒性傳染病，該病給各國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損 失。自我國分離到該病毒以來，國內(nèi)至少有22個(gè)省份發(fā)現(xiàn)該傳染病，該傳染病在有些省份 甚至流行過。隨著PRRSV的遺傳和變異，尤其是2006年后，HP-PRRSV變異株的出現(xiàn)，給養(yǎng)豬 業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。免疫接種是目前防制PRRS的主要措施，但是PRRS滅活疫苗保護(hù)率 低，活疫苗不能免疫妊娠母豬和種豬，使豬群存在免疫空白，不利于該病的徹底防制。PRRSV 的高變異性也給疫苗免疫帶來新的挑戰(zhàn)。
[0003] GP5蛋白是PRRSV的重要結(jié)構(gòu)蛋白之一，能起到參與體液免疫和細(xì)胞免疫的作用， 并具有較高的免疫原性和中和活性，是研宄PRRSV免疫保護(hù)的熱點(diǎn)蛋白。但是，以GP5蛋 白為靶蛋白的亞單位疫苗免疫效果并不理想，可能原因是：（1)GP5蛋白是糖基化的囊膜蛋 白，含有高度保守的N-糖基化位點(diǎn)和高疏水區(qū)的信號肽序列，因而在大腸埃希菌等表達(dá)系 統(tǒng)中的表達(dá)一直不夠理想，很難表達(dá)出完整的GP5蛋白，在以往的研宄中，多通過去除基因 N端的信號肽序列或跨膜區(qū)或通過密碼子優(yōu)化等手段以期獲得GP5蛋白的表達(dá)，但多以包 涵體形式存在，可能影響GP5蛋白的生物學(xué)功能，尤其后期還需蛋白質(zhì)復(fù)性才能獲得可溶 性蛋白，而復(fù)性是十分復(fù)雜的過程，且復(fù)性效率往往與特定蛋白質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，選擇何種方 法也需要反復(fù)試驗(yàn)，操作繁瑣；（2)GP5蛋白抗原遞呈作用比較弱。
[0004] pCold TF DNA為重組質(zhì)粒載體，帶有CspA(冷休克蛋白A)啟動(dòng)子及相關(guān)元件，使 得菌體在低溫15°C環(huán)境下培養(yǎng)時(shí)，目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量得到了提高，此外，pCold TF DNA自帶 一段可溶性標(biāo)簽Trigger Factor (TF)，其作用是促使融合蛋白盡可能以可溶的形式存在， 有效提高目的蛋白質(zhì)的可溶性。
[0005] TAT 是人免疫缺陷病毒 1 型（human immunodeficiency virus type 1，HIV_1)編 碼的反式轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白（trans-activator of transcription)的英文簡稱。TAT蛋 白中含有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域（PTD)，是一段富含堿性氨基酸且?guī)д姾傻亩嚯模ê?1個(gè)核心 氨基酸YGRKKRRQRRR)，該區(qū)域與蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能有關(guān)，能夠攜帶外源生物大分子物質(zhì)如蛋 白質(zhì)、多肽、核酸等通過細(xì)胞膜等生物活性膜，甚至可以通過血腦屏障。近年來，關(guān)于TAT 跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的應(yīng)用及免疫促進(jìn)等方面的研宄越來越多。2006年，Kittiworakarn J等 的實(shí)驗(yàn)研宄表明，HIV-TAT具有自佐劑（autoadjuvant)的能力，在沒有佐劑存在的情況 下，合成的TAT101即能增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)，而這種罕見的功能受控于HIV-TAT蛋白核心 區(qū)域以及其形成半胱氨酸介導(dǎo)的寡聚物的能力（Kittiworakarn J，Lecoq A，Moine G，et al. HIV-ITat raises an adjuvant-free humoral immune response controlled by its core region and its ability to formcysteine-mediated oligomers[J]. J Biol Chem， 2006,281(6) !3105-3115)。2010年，Kronenberg等在抗擊利什曼原蟲的研宄中，利用TAT 融合蛋白能有效刺激⑶8+T細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)性免疫反應(yīng)（Kronenberg K，Brosch S，Butsch F，et al. Vaccination with TAT-antigen fusion protein induces protective, CD8 (+) T cell-mediated immunity against Leishmania major[J]. Journal of Investigative Dermatology，2010,130(11) :2602-2610)。Gadzinski 等于 2012 年發(fā)現(xiàn) HIV-TAT 蛋白增強(qiáng) 體液免疫應(yīng)答的這種能力可以轉(zhuǎn)移到無關(guān)抗原DT92-106(白喉毒素多肽）及T24-36(黑 頸眼鏡蛇α毒素多肽）上，即增強(qiáng)這兩種合成抗原引起的免疫反應(yīng)，而相比之下完整的 ΤΑΤ1-57多肽片段比部分片段ΤΑΤ37-57的免疫效果好（Gadzinski A，Matz D，F(xiàn)avre E，et al. Transfer of the ability of HIV-I Tat to raise an adjuvant-free humoral immune response to unrelated antigens [J]· Vaccine，2012, 30 (18) :2859-2868)。同時(shí)，Wu 等通 過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了 HIV-TAT的另一功能，該研宄采用融合表達(dá)的方法，利用TAT的核心肽段可以 提高外源蛋白EGFP在大腸桿菌中的高效可溶性表達(dá)（Wu Y，Ren C，Gao Y et al. A novel method for promot ing heterologous protein expression in Escherichia coli by fusion with the HIV-I TAT core domain[J]. Amino Acids,2010,39 ：811-820)〇
[0006] 因此，本發(fā)明選用pCold TF DNA高效可溶性表達(dá)了 PRRSV變異株GP5蛋白及 TAT-GP5融合蛋白，豚鼠免疫接種試驗(yàn)表明，TAT-GP5融合蛋白能夠顯著提高機(jī)體體液免疫 和細(xì)胞免疫水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種新的可溶性表達(dá)的豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株 GP5重組蛋白及其制備方法及應(yīng)用，融合TAT后，提高了重組蛋白的免疫原性。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0009] 一種新的豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株GP5重組蛋白，為可溶性表達(dá)PRRSV GP5完整蛋白或者可溶性表達(dá)融合TAT的PRRSV GP5蛋白，所述可溶性表達(dá)PRRSV GP5完 整蛋白的核苷酸序列為：GGGGTACCATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATTGCTTTC TTTGTGGTGTATCGTGCTGTGCTATCTTGCTGTGCTCGTCAACGCCAGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGA TTTATAACTTAACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGACTTTT GTCATCTTCCCCGCGTTGACTCACATTGTTTCCTATGGGGCACTCACCACCAGCCATTTCCTTGACACAGTTGGTCT GGCCACTGTGTCCACCGCCGGATATTATCACGGGCGGTATGTCTTGAGTAGCATTTACGCAGTCTGTGCTCTGGCTG CGCTGATTTGCTTTGTCATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTT CCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTTTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGAAAAGGGGTAAGGTTGAGGTC GAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGG AACTATGGGGTCGTCCCTAG，如SEQID NO :1所示，其中，斜體部分為引物區(qū)域；所述可溶性表達(dá) 融合 TAT 的 PRRSV GP5 蛋白的核苷酸序列為：GGGGTACCGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAC CTCCTCAATGCATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATTGCTTTCTTTGTGGTGTATCGTGCTG TGCTATCTTGCTGTGCTCGTCAACGCCAGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTAACGCTATG TGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGACTTTTGTCATCTTCCCCGCGTTGA CTCACATTGTTTCCTATGGGGCACTCACCACCAGCCAT TTCCTTGACACAGTTGGTCTGGCCACTGTGTCCACCGC CGGATATTATCACGGGCGGTATGTCTTGAGTAGCATTTACGCAGTCTGTGCTCTGGCTGCGCTGATTTGCTTTGTCA TTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGC AGACTTTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGAAAAGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCT CAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACTATGGGGTCGTCCCTAG， 如SEQ ID NO :2所示，其中，斜體部分為引物區(qū)域，粗體部分為TAT序列。
[0010] 所述的新的豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株GP5重組蛋白的制備方法，包括以下 步驟：
[0011] (1)目的基因的克隆，包括以下步驟：
[0012] 11)引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)美洲型PRRSV變異株LX13(2)核苷酸序列，設(shè)計(jì)擴(kuò) 增 TAT-0RF5(V)及 0RF5(V)基因的兩對特異性引物 TAT-0RF5(V)-P1、TAT-0RF5(V)-P2 和 0RF5(V)-P1、0RF5(V)-P2,引物 TAT-0RF5(V)-P1 的核苷酸序列為 5' -GGGGTACCGGCAGGAAGA AGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAATGCATGTTGGGGAAGTGCTTG-3'，如 SEQ ID NO :3 所示，引物 TAT-0RF5 (V) -P2 的核苷酸序列為 5' -GGAATTCCTAGAGACGACCCCATAG-3'，如 SEQ ID NO :4 所 示，引物 0RF5(V)-P1 的核苷酸序列為 5'-GGGGTACCATGTTGGGGAAGTGCTTG-3'，如 SEQ ID NO ： 5 所示，引物 0RF5 (V) -P2 的核苷酸序列為 5' -GGAATTCCTAGAGACGACCCCATAG-3'，如 SEQID NO :6所示；其中，粗體部分為TAT序列，并在引物的上、下游5'端分別引入EcoR I和Kpn I 酶切位點(diǎn)；在引物合成后，用CldH2O稀釋為終濃度為20ρπι〇1/μ?，置-20°C保存；
[0013] 12) TAT-0RF5 (V)及 0RF5 (V)的擴(kuò)增：以重組質(zhì)粒 pMD18-T-0RF5 (V)為模板， 用無菌CldH2O稀釋20倍后，以引物TAT-0RF5 (V) -P1/TAT-0RF5 (V) -P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增 TAT-0RF5 (V);以引物 0RF5 (V) -P1/0RF5 (V) -P2 擴(kuò)增 0RF5 (V)基因；PCR產(chǎn)物進(jìn)行 1 %瓊脂糖 凝膠電泳，并利用MiniBEST DNA快速膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物；
[0014] (2)重組原核表達(dá)載體pCold-TF-TAT-GP5 (V)及pCold-TF-GP5 (V)的構(gòu)建及鑒定， 包括以下步驟：
[0015] 21)原核表達(dá)載體pCold TF DNA和目的基因的雙酶切回收；
[0016] 22)目的片段與表達(dá)載體的連接；
[0017] 23)重組表達(dá)質(zhì)粒 pCold-TF-TAT-GP5 (V)和 pCold-TF-GP5 (V)的鑒定；
[0018] (3)重組原核表達(dá)質(zhì)粒pCold-TF-TAT-GP5(V)及pCold-TF-GP5(V)的誘導(dǎo)表達(dá)，包 括以下步驟：
[0019] 31)重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞；
[0020] 32)重組菌的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；
[0021 ] 33)重組蛋白的可溶性分析；
[0022] (4)重組表達(dá)蛋白TF-TAT-GP5 (V)及TF-GP5 (V