核酸適配體在識(shí)別并結(jié)合整合素α4中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)與臨床醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及核酸適配體在識(shí)別并結(jié)合整 合素a4中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 核酸適配體（aptamer)是一類能與祀標(biāo)物質(zhì)的特異性相互作用的單鏈DNA、RNA、 膚核酸或化學(xué)修飾的核酸序列，通常由15-80個(gè)核巧酸組成。核酸適配體可W形成特定的 S維結(jié)構(gòu)與祀標(biāo)分子高親和力結(jié)合，如發(fā)卡、假結(jié)、G-四鏈體等結(jié)構(gòu)，高特異性地結(jié)合作用 是通過范德華力、氨鍵、靜電作用和疏水作用等分子間相互作用實(shí)現(xiàn)的。其具有親和力高、 特異性好、無免疫原性、易合成、改造與修飾、生物化學(xué)穩(wěn)定性好、能可逆變性與復(fù)性等特 性，所W被稱之為"化學(xué)抗體"。
[0003]核酸適配體可被應(yīng)用在一些疾病的診斷和檢測(cè)、藥物祀點(diǎn)定位、新藥研發(fā)和運(yùn)輸 相關(guān)藥物分子等領(lǐng)域，目前，用于治療癌癥、艾滋病等疾病的核酸適配體也不斷涌現(xiàn)。例如， 由Eyetch/Pfizer開發(fā)的祀向VEGF的核酸適配體（商品名Macugen) 2004年已獲得抑A的 批準(zhǔn)，成功地用于治療年齡相關(guān)的黃斑變性。近年提出的利用細(xì)胞-SELEX技術(shù)篩選特異性 核酸適配體，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物的方法具有好的應(yīng)用前景。但目前只有極少數(shù)成功的例 子，其中的瓶頸問題就在于位于細(xì)胞膜上的核酸適配體祀分子的純化/鑒定。
[0004] 整合素a4又稱CD49d，與整合素0 1亞單位（CD29)組成a4 0 1整合素。主要表 達(dá)于胸腺細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋己細(xì)胞等，配體是VCAM-1和纖連蛋白，能為T細(xì)胞活化和增殖 提供協(xié)同刺激信號(hào)，參與淋己細(xì)胞間黏附W及白細(xì)胞向炎癥部位遷移，同時(shí)其也表達(dá)于一 些實(shí)體瘤表面。研究表明；血栓的形成、白細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、血管發(fā)生和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移都與整 合蛋白的激活有關(guān)，其中，CD49d的異常表達(dá)與某些血液疾病的發(fā)病及預(yù)后有關(guān)，如CD49d 與慢性淋己細(xì)胞性白血?。ɑ痳oniclymphoidleukemia,化L)預(yù)后關(guān)系密，所WCD49d被 作為基于流式細(xì)胞儀分析慢性淋己細(xì)胞白血病的生物標(biāo)志物。
[0005] 多發(fā)性硬化癥（M巧是一種常見的慢性、炎癥性、脫髓銷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，損 害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓銷質(zhì)，從而造成神經(jīng)功能缺損，該種損傷往往會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重殘疾。每 100000人中有2-150人發(fā)病，全世界有超過一百萬人受到該種疾病的困擾，種族和地理紳 度的不同其發(fā)病率也不同。那他珠單抗（化talizumab)是ELAN公司研究開發(fā)的人源化單 抗，作用祀點(diǎn)整合素a4, 2004年被美國(guó)抑A批準(zhǔn)，2006年被歐盟EMA批準(zhǔn)，目前已經(jīng)在加拿 大、瑞±、澳大利亞等65個(gè)W上國(guó)家被批準(zhǔn)上市，商品名Tys油ri，主要用于多發(fā)性硬化癥 的治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供核酸適配體或其衍生物的新用途。
[0007] 本發(fā)明提供了核酸適配體或其衍生物在識(shí)別并結(jié)合或輔助識(shí)別并結(jié)合整合素a4 中的應(yīng)用；
[0008] 或核酸適配體或其衍生物在制備識(shí)別并結(jié)合或輔助識(shí)別并結(jié)合整合素a4的產(chǎn) 品中的應(yīng)用；
[0009] 所述核酸適配體為序列1所示的單鏈DNA分子。
[0010] 本發(fā)明還提供了核酸適配體或其衍生物在識(shí)別并結(jié)合或輔助識(shí)別并結(jié)合活性整 合素a4中的應(yīng)用；
[0011] 或核酸適配體或其衍生物在制備識(shí)別并結(jié)合或輔助識(shí)別并結(jié)合活性整合素a4 的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0012] 所述核酸適配體為序列1所示的單鏈DNA分子。
[0013] 本發(fā)明還提供了核酸適配體或其衍生物在檢測(cè)或輔助檢測(cè)與抗整合素a4的抗 體結(jié)合的物質(zhì)中的應(yīng)用；
[0014] 或核酸適配體或其衍生物在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)與抗整合素a4的抗體結(jié)合的 物質(zhì)的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0015] 所述核酸適配體為序列1所示的單鏈DNA分子。
[0016] 本發(fā)明還提供了核酸適配體或其衍生物在檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品是否含有整 合素a4中的應(yīng)用；
[0017] 或核酸適配體或其衍生物在檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中整合素a4的含量中的 應(yīng)用；
[0018] 或核酸適配體或其衍生物在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品是否含有整合素a4 的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0019] 或核酸適配體或其衍生物在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中整合素a4的含量 的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0020] 所述核酸適配體為序列1所示的單鏈DNA分子。
[0021] 本發(fā)明還提供了核酸適配體或其衍生物在制備診斷和/或治療多發(fā)性硬化癥的 產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0022] 所述核酸適配體為序列1所示的單鏈DNA分子。
[0023] 上述應(yīng)用中，所述衍生物為如下（1)-(6)中任一所述的核酸適配體的衍生物：
[0024] (1)將序列1所示的核酸適配體刪除或增加一個(gè)或幾個(gè)核巧酸，得到與所述核酸 適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[00巧](2)將序列1所示的核酸適配體進(jìn)行核巧酸取代或修飾，得到與所述核酸適配體 具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0026] (3)將序列1所示的核酸適配體的骨架改造為硫代磯酸脂骨架，得到與所述核酸 適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0027](4)由序列1所示的核酸適配體編碼的RNA分子，得到與所述核酸適配體具有相同 功能的核酸適配體衍生物；
[0028] (5)由序列1所示的核酸適配體編碼的膚核酸，得到與所述核酸適配體具有相同 功能的核酸適配體的衍生物；
[0029] (6)將序列1所示的核酸適配體的一端或中間接上信號(hào)分子和/或活性分子和/ 或功能基團(tuán)，得到與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0030] 所述化）中的功能基團(tuán)為生物素基團(tuán)或巧光基團(tuán)。
[0031] 上述應(yīng)用中，所述核酸適配體的衍生物為在上述核酸適配體的5'端或3'端標(biāo)記 巧光基團(tuán)或生物素基團(tuán)。
[0032] 上述應(yīng)用中，所述核酸適配體的衍生物為在上述核酸適配體的5'端標(biāo)記巧光基團(tuán) 或生物素基團(tuán)。
[0033] 上述應(yīng)用中，所述待測(cè)樣品為細(xì)胞；所述細(xì)胞具體為大鼠肺泡上皮細(xì)胞RAEC、人 胚胎肺纖維細(xì)胞MRC-5、人肺泡上皮細(xì)胞A549、人宮頸癌細(xì)胞化la、人肝癌細(xì)胞化h-7、人膀 脫癌細(xì)胞T24、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞SK-Hep-1、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7R、人卵 巢癌細(xì)胞SK0V-3、人白血病細(xì)胞K562、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、人類上皮癌細(xì)胞A431、人 類T細(xì)胞白血病細(xì)胞化rkatE6-1、人回盲腸腺癌細(xì)胞肥T-8、人胚胎腎細(xì)胞肥K-293、人前 列腺癌細(xì)胞PC-3、人類T細(xì)胞淋己瘤化t-78或人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo。
[0034] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)品。
[0035] 本發(fā)明提供的產(chǎn)品的活性成分為序列1所示的核酸適配體或其衍生物；所述產(chǎn)品 的用途為如下1)-6)中的至少一種：
[0036] 1)識(shí)別并結(jié)合或輔助識(shí)別并結(jié)合整合素a4;
[0037] 2)識(shí)別并結(jié)合或輔助識(shí)別并結(jié)合活性整合素a4;
[0038] 3)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品的整合素a4的含量；
[0039] 4)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有整合素a4;
[0040] 5)檢測(cè)或輔助檢測(cè)與抗整合素a4的抗體結(jié)合的物質(zhì)；
[0041] 6)診斷和/或治療多發(fā)性硬化癥。
[0042] 上述產(chǎn)品中，所述衍生物為如下（1)-(6)中任一所述的核酸適配體的衍生物：
[0043](1)將序列1所示的核酸適配體刪除或增加一個(gè)或幾個(gè)核巧酸，得到與所述核酸 適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0044] (2)將序列1所示的核酸適配體進(jìn)行核巧酸取代或修飾，得到與所述核酸適配體 具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0045] (3)將序列1所示的核酸適配體的骨架改造為硫代磯酸脂骨架，得到與所述核酸 適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0046] (4)由序列1所示的核酸適配體編碼的RNA分子，得到與所述核酸適配體具有相同 功能的核酸適配體衍生物；
[0047] (5)由序列1所示的核酸適配體編碼的膚核酸，得到與所述核酸適配體具有相同 功能的核酸適配體的衍生物；
[0048] (6)將序列1所示的核酸適配體的一端或中間接上信號(hào)分子和/或活性分子和/ 或功能基團(tuán)，得到與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物；
[0049] 所述化）中的功能基團(tuán)為生物素基團(tuán)或巧光基團(tuán)。
[0050] 上述應(yīng)用中，所述核酸適配體的衍生物為在上述核酸適配體的5'端或3'端標(biāo)記 巧光基團(tuán)或生物素基團(tuán)。
[0051] 上述應(yīng)用中，所述核酸適配體的衍生物為在上述核酸適配體的5'端標(biāo)記巧光基團(tuán) 或生物素基團(tuán)。
[0052] 上述產(chǎn)品中，所述待測(cè)樣品為細(xì)胞；所述細(xì)胞具體為大鼠肺泡上皮細(xì)胞RAEC、人 胚胎肺纖維細(xì)胞MRC-5、人肺泡上皮細(xì)胞A549、人宮頸癌細(xì)胞化la、人肝癌細(xì)胞化h-7、人膀 脫癌細(xì)胞T24、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞SK-Hep-1、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7R、人卵 巢癌細(xì)胞SK0V-3、人白血病細(xì)胞K562、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、人類上皮癌細(xì)胞A431、人 類T細(xì)胞白血病細(xì)胞化rkatE6-1、人回盲腸腺癌細(xì)胞肥T-8、人胚胎腎細(xì)胞肥K-293、人前 列腺癌細(xì)胞PC-3、人類T細(xì)胞淋己瘤化t-78或人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo。
[0053] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)核酸適配體Sgc-4e可W特異性識(shí)別并結(jié)合整合素a4,并利用核 酸適配體Sgc-4e與整合素a4的特異性結(jié)合作用建立了檢測(cè)整合素a4的方法。通過實(shí)驗(yàn) 證明；本發(fā)明的核酸適配體Sgc-4e具有親和力高、特異性強(qiáng)、無免疫原性和無毒性等特點(diǎn)， 基于核酸適配體Sgc-4e建立的檢測(cè)整合素a4的方法可為治療多發(fā)性硬化癥提供了新的 策略。
【附圖說明】
[0054] 圖1為Sgc-4e-Bio提取的整合素a4蛋白代表性的多膚的ESI-MS和MS/MS圖譜。 圖1A為重型同位素標(biāo)記的[M+2田"離子ESI-MS譜圖；圖1B為輕型同位素標(biāo)記的[M+2田" 離子ESI-MS譜圖；圖1C為重型同位素標(biāo)記的[M+2田"離子MS/MS譜圖，其中，R*表示重型 同位素標(biāo)記的精氨酸；圖1D為輕型同位素標(biāo)記的[M+2田"離子MS/MS譜圖。
[00巧]圖2為用Sgc-4e-FAM和anti-CD49d-PE或anti-CD29-陽抗體共染色的化rkat E6-1細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。其中，L45-FAM是巧光素標(biāo)記的對(duì)照核酸序列；IgG-PE 是對(duì)照抗體。
[0056] 圖3為抗整合素a4抗體或核酸適配體Sgc-4e分別與野生型K562細(xì)胞或轉(zhuǎn)染后 穩(wěn)定表達(dá)整合素a4的K562細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。
[0057]圖