針對整聯(lián)蛋白αvβ6的抗體和使用該抗體治療癌癥的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請要求于2012年2月17日提交的美國臨時申請第61/600, 499號和2012年 2月23日提交的美國臨時申請第61/602, 511號的權(quán)益，每個申請都通過引用全文納入本文 以用于所有目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0002] 本發(fā)明提供了特異性結(jié)合整聯(lián)蛋白α νβ 6的單克隆抗體，以及使用這些抗體治 療癌癥的方法。本文所述抗體包括15Η3抗體。所述15Η3抗體是一種鼠單克隆抗體，其包含 一個重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，以及一個輕鏈可變區(qū)， 所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。本發(fā)明包括15H3鼠抗體的嵌合和人源化 形式，以及其人形式。所述15H3抗體的嵌合、人源化和人形式包含基本上與鼠15H3抗體相 同的互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)并特異性結(jié)合整聯(lián)蛋白α νβ 6。所述鼠15H3抗體的三個重鏈可變區(qū) CDR 的序列為 SEQ ID N0:3(H-CDR1)、SEQ ID N0:4(H-CDR2)和 SEQ ID N0:5(H-CDR3)。所述 鼠15H3抗體的三個輕鏈可變區(qū)CDR的序列為SEQ ID N0:6(L-CDR1)、SEQ ID N0:7(L-CDR2) 和SEQ ID N0:8(L-⑶R3)。任選地，在包含與特異性結(jié)合整聯(lián)蛋白ανβ6的鼠15H3抗體基 本上相同的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)的人源化抗體中，重鏈可變區(qū)Η28、Η30、Η72、Η73、Η75、Η78或 Η93中的至少一個位置被來源于鼠15Η3抗體相應(yīng)位置的氨基酸殘基占據(jù)。任選地，在任意 的這類抗體中，Η28、Η30、Η72、Η73、Η75、Η78或Η93中的至少兩個位置被來源于鼠15Η3抗 體相應(yīng)位置的氨基酸殘基占據(jù)。任選地，在任意的這類抗體中，Η28、Η30、Η72、Η73、Η75、Η78 或Η93中的至少四個位置被來源于鼠15Η3抗體相應(yīng)位置的氨基酸殘基占據(jù)。任選地，在任 意的這類抗體中，Η28和Η30中的至少一個位置被S占據(jù)。任選地，在任意的這類抗體中， Η28和Η30位置被S占據(jù)。任選地，在任意的這類抗體中，Η28和Η30位置被S占據(jù)，Η72位 置被D或Q占據(jù)；Η73位置被T或K占據(jù)，Η75位置被T或S占據(jù)；Η78位置被V或A占據(jù)，且 93位置被A或V占據(jù)。任選地，在任意的這些實施方式中，重鏈構(gòu)架區(qū)中的不超過10個、不 超過9個、不超過8個、不超過7個、不超過6個或不超過5個氨基酸殘基被來源于鼠15Η3 抗體相應(yīng)位置的氨基酸殘基占據(jù)。任選地，在任意的這些實施方式中，重鏈可變區(qū)CDR的序 列為SEQ ID NO: 1，而輕鏈可變區(qū)⑶R的序列為SEQ ID NO: 2。任選地，在任意的這些實施 方式中，重鏈可變區(qū)⑶R的序列基本為SEQ ID NO: 1，而輕鏈可變區(qū)⑶R的序列基本為SEQ ID N0:2。任選地，在任意的這些實施方式中，重鏈可變區(qū)⑶R的序列為SEQ ID NO: 1，而輕 鏈可變區(qū)⑶R的序列為SEQ ID NO: 2,其中每個⑶R中有0、1、2或3個保守性氨基酸取代。 在一個方面，本發(fā)明提供了能夠特異性結(jié)合整聯(lián)蛋白α νβ 6的嵌合或人源化抗體，其包含 序列為 SEQ ID N0:3(CDR1)、SEQ ID N0:4(CDR2)和 SEQ ID N0:5(CDR3)的重鏈互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)，以及序列為 SEQ ID N0:6(CDR4)、SEQ ID N0:7(CDR5)和 SEQ ID N0:8(CDR6)的輕鏈 ⑶R，并且每個⑶R中有〇、1、2或3個保守性氨基酸取代。類似于本申請的其他部分，這里 的Kabat編號用于描述重鏈和輕鏈可變區(qū)中的位置。
[0003] 本發(fā)明還提供包括具有與HA(SEQ ID N0:9)有至少90%相同性的氨基酸序列的重 鏈可變區(qū)和具有與LA(SEQ ID NO: 10)有至少90%相同性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗 體（如人源化抗體）。在一些方面，本發(fā)明提供包括具有與HA(SEQ ID N0:9)有至少90% 相同性且在重鏈可變框架區(qū)中有至少一個鼠15H3回復(fù)突變的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和 與LA(SEQ ID NO: 10)有至少90%相同性的輕鏈可變區(qū)的抗體。短語"在重鏈可變框架區(qū)中 有至少一個鼠15H3回復(fù)突變"指受體可變鏈框架區(qū)中的至少一個氨基酸殘基改變?yōu)楣w鼠 15H3抗體相應(yīng)位置的一個氨基酸殘基。任選地，在任意的這類抗體中，H28、H30、H72、H73、 H75、H78或H93中的至少一個位置被來源于鼠15H3抗體相應(yīng)位置的氨基酸殘基占據(jù)。任 選地，在任意的這類抗體中，H28、H30、H72、H73、H75、H78或H93中的至少兩個位置被來源 于鼠15H3抗體相應(yīng)位置的氨基酸殘基占據(jù)。任選地，在任意的這類抗體中，H28、H30、H72、 H73、H75、H78或H93中的至少四個位置被來源于鼠15H3抗體相應(yīng)位置的氨基酸殘基占據(jù)。 任選地，在任意的這類抗體中，H28、H30、H72、H73、H75、H78或H93中的所有位置被來源于 鼠15H3抗體相應(yīng)位置的氨基酸殘基占據(jù)。任選地，在任意的這類抗體中，H28和H30中的至 少一個位置被S占據(jù)。任選地，在任意這類抗體中，H28和H30位置被S占據(jù)。任選地，在任 意這類抗體中，H28和H30位置被S占據(jù)，H72位置被D或Q占據(jù)；H73位置被T或K占據(jù)， H75位置被T或S占據(jù)；H78位置被V或A占據(jù)，且93位置被A或V占據(jù)。任選地，在任意 的這些實施方式中，重鏈構(gòu)架區(qū)中的不超過10個、不超過9個、不超過8個、不超過7個、不 超過6個或不超過5個氨基酸殘基被來源于鼠15H3抗體相應(yīng)位置的氨基酸殘基占據(jù)。任 選地，在任意的這些實施方式中，重鏈可變區(qū)⑶R的序列為SEQ ID N0:1，而輕鏈可變區(qū)⑶R 的序列為SEQ ID N0:2。任選地，在任意的這些實施方式中，重鏈可變區(qū)CDR的序列基本為 SEQ ID NO: 1，而輕鏈可變區(qū)⑶R的序列基本為SEQ ID NO: 2。任選地，在任意的這些實施方 式中，重鏈可變區(qū)⑶R的序列為SEQ ID NO: 1，而輕鏈可變區(qū)⑶R的序列為SEQ ID N0:2,其 中每個⑶R中有0、1、2或3個保守性氨基酸取代。
[0004]本發(fā)明還提供了包括具有與 HB(SEQ ID N0:11)、HF(SEQ ID N0:12)、HG(SEQ ID N0:13)、HK(SEQ ID N0:14)、HL(SEQ ID N0:15)、HM(SEQ ID N0:16)、HN(SEQ ID N0:17)、 H0(SEQ ID N0:18)、HQ(SEQ ID N0:19)、HR(SEQ ID N0:20)、HS(SEQ ID N0:21)、HT(SEQ ID N0:22)或HU(SEQ ID N0:23)有至少90%相同性的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和具有與 LA(SEQ ID N0:10)、LB(SEQ ID N0:24)、LC(SEQ ID N0:25)、LD(SEQ ID N0:26)、LE(SEQ ID NO: 27)、LF (SEQ ID NO:28)或LG (SEQ ID NO:29)有至少90%相同性的氨基酸序列的輕鏈 可變區(qū)，及其任意組合（即抗體可包含與任一輕鏈可變區(qū)配對的任一重鏈可變區(qū)）的抗體 (如人源化抗體）。任選的，所述抗體包含具有與HA、HB、HF、HG、HK、HL、HM、HN、H0、HQ、HR、 HS、HT、HU有至少95%相同性的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和與LA、LB、LC、LD、LE、LF或LG 有至少95%相同性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，及其任意組合（即抗體可包含與任一輕鏈 可變區(qū)配對的任一重鏈可變區(qū)）。任選地，在任意的這類抗體中，H28、H30、H72、H73、H75、 H78或H93中的至少一個位置被來源于鼠15H3抗體相應(yīng)位置的氨基酸殘基占據(jù)。任選地， 在任意的這類抗體中，H28、H30、H72、H73、H75、H78或H93中的至少兩個位置被來源于鼠 15H3抗體相應(yīng)位置的氨基酸殘基占據(jù)。任選地，在任意的這類抗體中，H28和H30中的至少 一個位置被S占據(jù)。任選地，在任意這類抗體中，H28和H30位置被S占據(jù)。任選地，在任 意這類抗體中，H28和H30位置被S占據(jù)；H72位置被D或Q占據(jù)；H73位置被T或K占據(jù)， H75位置被T或S占據(jù)；H78位置被V或A占據(jù)，且93位置被A或V占據(jù)。任選地，在任意 的這些實施方式中，重鏈構(gòu)架區(qū)中的不超過10個、不超過9個、不超過8個、不超過7個、不 超過6個或不超過5個氨基酸殘基被來源于鼠15H3抗體相應(yīng)位置的氨基酸殘基占據(jù)。任 選地，在任意的這些實施方式中，重鏈可變區(qū)⑶R的序列為SEQ ID ΝΟ:1，而輕鏈可變區(qū)⑶R 的序列為SEQ ID NO:2。任選地，在任意的這些實施方式中，重鏈可變區(qū)CDR的序列基本為 SEQ ID NO: 1，而輕鏈可變區(qū)⑶R的序列基本為SEQ ID NO: 2。任選地，在任意的這些實施方 式中，重鏈可變區(qū)⑶R的序列為SEQ ID NO: 1，而輕鏈可變區(qū)⑶R的序列為SEQ ID N0:2,其 中每個CDR中有0、1、2或3個保守性氨基酸取代。本文所述抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變 區(qū)可任選地與一段信號肽融合。示例性重鏈?zhǔn)笮盘栯牧杏赟EQ ID N0:33;示例性重鏈人信 號肽列于SEQ ID NO:34;示例性輕鏈?zhǔn)笮盘栯牧杏赟EQ ID NO:35;并且示例性輕鏈人信號 肽列于 SEQ ID NO:36。
[0005] 本文所述抗體的重鏈可變區(qū)任選地與重鏈恒定區(qū)融合且輕鏈可變區(qū)任選地與輕 鏈恒定區(qū)融合。所述重鏈恒定區(qū)可以是天然的人恒定區(qū)或可以是天然的人恒定區(qū)的一種突 變形式，例如與Fcy受體的結(jié)合比天然的人恒定區(qū)弱。任選地，所述重鏈恒定區(qū)為IgGl同 種型。任選地，所述重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID N0:30且所述輕鏈恒定區(qū)的氨基 酸序列包含SEQ ID N0:31。任選地，所述重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID N0:32且 所述輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID N0:31。任選地，所述抗體偶聯(lián)至一種細(xì)胞毒劑 (即抗體-藥物偶聯(lián)）。本發(fā)明中的特定抗體與人α V β 6的親和性高于鼠15H3抗體。一 些其他的抗體與人α νβ 6的親和性比鼠15Η3抗體低不超過10倍、優(yōu)選不超過6倍、更優(yōu) 選不超過5倍、更優(yōu)選不超過2倍，上述結(jié)果由競爭結(jié)合試驗或飽和結(jié)合試驗確定（如實施 例中所述）。在一些方面，本文所述人源化抗體與人α νβ 6的親和性是鼠15Η3抗體與人 α V β 6的親和性的約10倍以內(nèi)、優(yōu)選約5倍以內(nèi)、更優(yōu)選約2倍以內(nèi)。在一些方面，本文所 述人源化抗體相對于人α V β 6的表觀解離常數(shù)（kd)的范圍為0.1 nM至10ηΜ、優(yōu)選0.1 nM 至 5nM、更優(yōu)選 0· InM 至 2ηΜ、0· 5nM 至 2nM 或 0· 5nM 至 I. 5nM。
[0006] 還提供了包含本文所述氨基酸序列的雙特異性單克隆抗體。
[0007] 本發(fā)明還提供了編碼上文所述任意抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的核酸。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種治療癌癥患者的方法，包含以有效的方案給予患者一種上文 所述抗體。所述抗體優(yōu)選偶聯(lián)至一種細(xì)胞毒劑。所述癌癥為表達(dá)ανβ 6抗原的癌癥。任 選地，所述癌癥為膀胱癌、頭頸癌（包括唇、口腔、鼻腔、鼻旁竇、咽和喉的癌癥）、皮膚癌、肺 癌、胰腺癌、子宮癌、乳腺癌（包括三重陰性乳腺癌）、宮頸癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌、胃 癌或肝癌。任選地，所述癌癥是一種鱗狀細(xì)胞癌或腺癌。 附圖簡要說明
[0009] 圖1顯示了親本鼠 mAb (稱作15Η3)與選擇的人源化15Η3重鏈（上方兩行）和輕 鏈（下方兩行）可變區(qū)的氨基酸序列比對。
[0010] 圖2顯示了表達(dá)人α V β 6的293F細(xì)胞與含有HB重鏈的抗體和親本鼠抗體（稱 作ml5H3)進(jìn)行的競爭結(jié)合研究的結(jié)果。
[0011] 圖3A-C顯示了表達(dá)α V β 6的293F細(xì)胞及FDC-Pl細(xì)胞與抗體HBLC和HTLC進(jìn)行 的飽和結(jié)合研究的結(jié)果。
[0012] 圖4顯示了在表達(dá)α V β 6的293F細(xì)胞與含有HB、HL和HN重鏈的抗體和親本鼠 抗體（稱作ml5H3)進(jìn)行的競爭結(jié)合研究的結(jié)果。
[0013] 圖5顯示了在表達(dá)a v β 6的293F細(xì)胞與含有HB、HQ和HR重鏈的抗體和親本鼠 抗體（稱作ml5H3)進(jìn)行的競爭結(jié)合研究的結(jié)果。
[0014] 圖6顯示了表達(dá)α V β 6的293F細(xì)胞與含有HM重鏈的抗體和親本鼠抗體（稱作 ml5H3)的競爭結(jié)合研究的結(jié)果。
[0015] 圖7顯示了在表達(dá)α νβ 6的293F細(xì)胞與含有HB、HL、HS、HT和HU重鏈的抗體和 親本鼠抗體（稱作ml5H3)進(jìn)行的競爭結(jié)合研究的結(jié)果。
[0016] 圖8顯示了來源于腫瘤微陣列的由膀胱癌樣品上IHC表達(dá)的α νβ 6蛋白表達(dá)分 析。
[0017] 圖9A-9F表明在細(xì)胞毒性測定中人源化15Η3抗α V β 6ADC與鼠親本的表現(xiàn)類似。
[0018] 圖10顯示了裸小鼠中Detroit 562頭頸癌細(xì)胞系的移植研究的結(jié)果。圖中顯示 了劑量。當(dāng)腫瘤達(dá)到約IOOmm3時進(jìn)行第一次給藥。
[0019] 圖11顯示了裸小鼠中HPAFII胰腺癌細(xì)胞系的移植研究的結(jié)果。圖中顯示了給藥 的劑量和時間。
[0020] 圖12顯示了裸小鼠中BxPC-3胰腺癌細(xì)胞系的移植研究的結(jié)果。圖中顯示了給藥 的劑量和時間。 發(fā)明詳述
[0021] 本發(fā)明提供了（但不限于）特異性結(jié)合ανβ 6的單克隆抗體及其偶聯(lián)物。所述 抗體可用于治療和診斷ανβ 6表達(dá)相關(guān)的疾?。òǘ喾N癌癥）以及檢測ανβ 6。特異 性結(jié)合α V β 6的抗體特異性結(jié)合單獨(dú)的β 6整聯(lián)蛋白亞基和/或α V β 6整聯(lián)蛋白復(fù)合物 但不結(jié)合單獨(dú)的αν亞基。
[0022] -種"分離的"抗體表示一種已經(jīng)從其天然環(huán)境中鑒定并分離和/或回收的抗體 和/或一種重組產(chǎn)生的抗體。一種"純化后抗體"表示一種相對于其生產(chǎn)或純化過程中產(chǎn) 生的干擾蛋白和其他污染物通常有至少50% w/w純度的抗體，但并不排除抗體與過量的藥 學(xué)上可接受的載體或其他旨在方便其使用的載劑結(jié)合。干擾蛋白和其他污染物可包括例如 從中分離或重組產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的細(xì)胞組分。有時抗體相對于生產(chǎn)或純化過程中的干擾蛋 白和污染物有至少60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或99 % w/w純度。本文所述抗體（包括鼠、 嵌合、人源化和人抗體）可以以分離和/或純化后的形式提供。
[0023] 本文所用術(shù)語"單克隆抗體"指獲自基本均一抗體群的抗體，即除了少數(shù)出現(xiàn)可能 的天然產(chǎn)生突變外，群體包含的單獨(dú)抗體是相同的。定語"單克隆"表明抗體特征在于獲自 基本均一的抗體群，而不應(yīng)解釋為需要通過任何特定方法產(chǎn)生所述抗體。例如，根據(jù)本發(fā) 明所用的單克隆抗體可通過首先記載在Kohler等，Nature256:495(1975)的雜交瘤方法， 或通過重組DNA方法制備（參見例如美國專利號4816567)。也可通過例如Clackson等， Nature 352:624-628 (1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1991)記載的技術(shù)或其 他方法從噬菌體抗體文庫中分離"單克隆抗體"。本文所述抗體是單克隆抗體。
[0024] 單克隆抗體與其目標(biāo)抗原的特異性結(jié)合表明親和性至少為106、107、10 8、109或 IOwM \可檢測到在量級上更高并將其與至少一個不相關(guān)目標(biāo)物的非特異性結(jié)合區(qū)分。特異 性結(jié)合可以是特定功能基團(tuán)之間形成的鍵或特定空間適合（如鎖和鑰匙類型）的結(jié)果，而 非特異性結(jié)合通常是范德華力的結(jié)果?？赏ㄟ^已知方法測定抗體與ανβ 6的特異性結(jié)合， 例如使用如Western印記、放射性免疫試驗、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗）、"三明治"免疫試 驗或免疫沉淀試驗技術(shù)的競爭性和非競爭性免疫試驗系統(tǒng)。
[0025] -個完整抗體的基礎(chǔ)抗體結(jié)構(gòu)單元是一個亞基四聚體。每個四聚體包括兩對相同 的多肽鏈，每對有一條"輕"鏈（約25kDa)和一條"重"鏈（約50-70kDa)。各鏈的氨基末端 部分包含約100-110或更多氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識別。該可變區(qū)在最初表達(dá)時 與一段可切割的信號肽相連。各鏈的羧基末端部分定義為主要負(fù)責(zé)效應(yīng)物功能的恒定區(qū)。