一株高產(chǎn)堿性蛋白酶的地衣芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一株高產(chǎn)堿性蛋白酶的地衣芽孢桿菌及 其應用。
【背景技術】
[0002] 堿性蛋白酶（alkaline protease)是指在pH值偏堿性范圍內水解蛋白質肽鍵的 酶類，其主要成分是一種內切蛋白酶，催化部位為絲氨酸，分子量約為27kDa。國內工業(yè)生 產(chǎn)蛋白酶的菌株多是經(jīng)地衣芽孢桿菌2709選育而來，是通過深層發(fā)酵、提取及精制而成 的一種蛋白水解酶。堿性蛋白酶廣泛應用于食品、醫(yī)療、釀造、絲綢、制革等行業(yè)，是工業(yè) 用酶中占據(jù)比例最大的酶類，約占全世界每年總銷售量的60%左右（Mala B.R.等，1998， Microbiology and Molecular Biology Reviews)〇
[0003] 堿性蛋白酶是目前市場上暢銷的洗滌添加劑，能大幅度提高洗滌劑的去污效果， 特別對血漬、汗?jié)n、奶漬、油漬等蛋白類污垢具有獨特的洗滌效果。但目前堿性蛋白酶產(chǎn)品 普遍被諾維信和杰能科兩大酶制劑國際公司壟斷，其具有酶活水平高、溶解速度快以及與 洗滌劑配伍時耐受性強的優(yōu)點。國內酶制劑企業(yè)要擴大在洗滌酶領域的市場份額，除了加 速開發(fā)出發(fā)酶學性質優(yōu)良的新型堿性蛋白酶外，也需要提高堿性蛋白酶的產(chǎn)量，從而降低 生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)堿性蛋白酶的地衣芽孢桿菌及其應用。本發(fā)明首先 通過將來源于克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii)的堿性蛋白酶基因轉入地衣芽孢桿菌 (Bacillus Iicheniformis)中，構建得到重組表達堿性蛋白酶的基因工程菌株；然后以該 工程菌株為出發(fā)菌進行紫外誘變，進而篩選出一株堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株，為低成本、規(guī)?；?生產(chǎn)堿性蛋白酶奠定了基礎。
[0005] 本發(fā)明一方面涉及一種地衣芽孢桿菌工程菌，其攜帶有能表達堿性蛋白酶的表達 載體。
[0006] 所述堿性蛋白酶的氨基酸序列為SEQ ID N0:1，其編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:2〇
[0007] 本發(fā)明另一方面涉及一種地衣芽孢桿菌突變株，為地衣芽孢桿菌 BL1-43 (Bacillus licheniformis BL1-43)，已于2015年7月13日保藏于中國武漢武漢大 學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M2015449。
[0008] 本發(fā)明還涉及上述地衣芽孢桿菌突變株的應用。
[0009] 本發(fā)明通過紫外誘變的方法獲得一株高產(chǎn)堿性蛋白酶的地衣芽孢桿菌突變株，其 搖瓶發(fā)酵酶活高達18000U/ml，較出發(fā)菌提高了約54. 5%，且經(jīng)多次傳代后，還能保持遺傳 上的穩(wěn)定性，取得了意料不到的技術效果，可廣泛應用于堿性蛋白酶的生產(chǎn)，有助于降低生 產(chǎn)成本，提高市場競爭力。
【附圖說明】
[0010] 圖1為質粒pWBA-aprE的遺傳圖譜。
【具體實施方式】
[0011] 下面結合實例對本發(fā)明的方法做進一步說明，實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克（Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所 述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。本領域相關的技術人員可以借助實施例更 好地理解和掌握本發(fā)明。但是，實現(xiàn)本發(fā)明的方法不應限于本發(fā)明實施例所記載的具體方 法步驟。
[0012] 對于本發(fā)明所涉及的術語及相關測定方法解釋如下：
[0013] 1、蛋白酶酶活測定方法：采用中華人民共和國國家標準蛋白酶制劑測定方法 (GB/T 25327-2009)〇
[0014] 2、酶活單位的定義：Ig固體酶粉（或ImL液體酶），在一定溫度和pH值條件下， Imin水解酪蛋白產(chǎn)生1 μ g酪氨酸，即為1個酶活力單位，以U/g(U/mL)表示。
[0015] 3、堿性蛋白酶運用福林法測定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括：福林使用溶液 (一份市售福林溶液與兩份水混合，搖勻），碳酸鈉溶液（42. 4g/L)，三氯乙酸（65. 4g/L)， 梯度pH值緩沖液，酪蛋白溶液（10.0 g/L)。反應過程如下：試管中加入ImL酶液，40°C溫浴 2min，加入酪蛋白溶液lmL，搖勻后40°C溫浴lOmin，加入2mL三氯乙酸溶液，搖勻（空白對 照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液）。取出靜止lOmin，慢速定性濾紙過濾。取ImL濾 液，加碳酸鈉溶液5mL，加福林試劑使用溶液lmL，40°C顯色20min，于680nm波長，用IOmm比 色皿測定吸光度。
[0016] 實施例1堿性蛋白酶表達載體構建
[0017] I. 1基因組DNA的提取
[0018] TIAN GEN公司的TIANamp Bacteria DNA Kit制備克勞氏芽孢桿菌基因組DNA，其 制備過程參照試劑盒的操作手冊。
[0019] 1. 2基因克隆
[0020] 以1. 1中提取的基因組總DNA為模版，利用引物I : 5 ' -TTTTAGTTCATCGATCGCATCGG CTGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATT-3 ' 和引物 2 :5 ' -GCTGAAGCTAGCTTGCATGCTTAATTTAGCGTGTTG CCGCTTCTGCATTG-3'進行PCR擴增，獲得aprE基因片段。擴增條件為98°C IOmin ;98°C 10s， 58°C 20s，72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C lOmin。利用 Ε· Ζ· N. A. Gel Extraction Kit 回收 PCR 擴增產(chǎn)物。
[0021] I. 3質粒的提取
[0022] TIAN GEN 公司的 TIANrep Rapid Mini Plasmid Kit 制備載體 pWB980,其制備過 程參照試劑盒的操作手冊。
[0023] 1. 4表達載體構建
[0024] 以 L 3 中提取的質粒 DNA 為模板，利用引物 1 :5' -CAATGCAGAAGCGGCAACACGCTAAA TTAAGCATGCAAGCTAGCTTCAGC-3' 和引物 2 :5' -AATATTTTTCTTTTGCTTCTTCAGCAGCCGATGCGATC GATGAACTAAAA-3'進行PCR擴增，獲得載體基因序列。擴增條件為98°C 10min;98°C 10s， 58°C 20s，72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C lOmin。利用 Ε· Ζ· N. A. Gel Extraction Kit 回收 PCR 擴增產(chǎn)物。
[0025] 將目標片段和載體片段通過重疊延伸PCR形成多聚體，擴增體系如下： 5XPhusion HF Buffer 10 μ L，2. 5mM dNTPs 8 μ L，Insert gene (aprE 片段）4yL， Linearized vector(pWB980)6 yL，Phusion DNA Polymerase I yL，ddH20 21 yL。擴增條件 為98。(：1〇111丨11;98。(：1〇8,721€3111丨11，20個循環(huán) ；98。(：1〇8,721€6111丨11，15個循環(huán)；72。(：1〇11^11。 將多聚體轉化枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)lA751宿主菌，得到陽性轉化子，測序驗 證。經(jīng)測序該aprE片段的核酸序列為SEQ ID NO: 2,其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1。 經(jīng)NCBI BLAST比對發(fā)現(xiàn)，SEQ ID NO: 1與克勞氏芽孢桿菌的堿性蛋白酶氨基酸序列相似性 為100%。將獲得的質粒命名為pWBA-aprE，質粒圖譜如圖1所示。
[0026] 利用感受態(tài)方法將pWBA-aprE轉化入枯草芽孢桿菌1A751宿主菌，具體轉化過程 如下：將新鮮活化的枯草芽孢桿菌1A751由LB平板（胰蛋白胨1%，酵母粉0. 5%，NaCl 1%)接種到51111611(611配制方法為：1\最低鹽溶液95.61111，20%葡萄糖2.51111， 5%水解酪蛋白0.4ml，10%酵母粉汁Iml ;其中IX最低鹽溶液的配制方法為=K2HPO4Hg/ L，KH2P046g/L，（NH4)2S0 42g/L，檸檬酸三鈉 lg/L，MgSO4 · 7H20 0. 2g/L，在蒸餾水中依次溶 解溶液，在30°C、125rpm振蕩培養(yǎng)過夜。第二天取2ml轉接到18ml GM I中，37°C、250rpm 培養(yǎng)3. 5h。再取IOml上一步驟的培養(yǎng)液轉接到90ml GM II (GM II配制方法為：1 X最 低鹽溶液96. 98ml，20 %葡萄糖2. 5ml，5 %水解酪蛋白0. 08ml，10 %酵母粉汁0. 04ml，IM MgCl2O. 25ml，IM CaCl20.0 5ml 中，37°C、125rpm 培養(yǎng) 90min 后，5