一種間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及應(yīng)用
【專利說明】一種間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及應(yīng)用 所屬技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及應(yīng)用，并提供了一種關(guān)節(jié)鏡沖洗液來源間 充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法和再生修復(fù)治療上的應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 關(guān)節(jié)鏡是一種觀察關(guān)節(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的直徑5_左右的棒狀光學(xué)器械，是用于診治關(guān) 節(jié)疾患的內(nèi)窺鏡。該器械從1970年開始推廣應(yīng)用。關(guān)節(jié)鏡在一根細(xì)管的端部裝有一個(gè)透 鏡，將細(xì)管插入關(guān)節(jié)內(nèi)部，關(guān)節(jié)內(nèi)部的結(jié)構(gòu)便會(huì)在監(jiān)視器上顯示出來。因此，可以直接觀察 到關(guān)節(jié)內(nèi)部的結(jié)構(gòu)。關(guān)節(jié)鏡不僅用于疾病的診斷，而且已經(jīng)廣泛用于關(guān)節(jié)疾病的治療。關(guān) 節(jié)鏡手術(shù)是一種微創(chuàng)手術(shù)，開始主要應(yīng)用于膝關(guān)節(jié)，后相繼應(yīng)用于髖關(guān)節(jié)，肩關(guān)節(jié)，踝關(guān)節(jié)， 肘關(guān)節(jié)及手指等小關(guān)節(jié)等。
[0003] 隨著內(nèi)鏡技術(shù)在我國逐漸普及，關(guān)節(jié)鏡手術(shù)已成為骨關(guān)節(jié)外科常規(guī)診療手段。至 今在全身各系統(tǒng)內(nèi)鏡中，關(guān)節(jié)鏡功能最全面、應(yīng)用最廣泛，并由此形成獨(dú)立的關(guān)節(jié)鏡外科。 關(guān)節(jié)鏡手術(shù)業(yè)務(wù)成為醫(yī)院和科室績效的增長點(diǎn)。
[0004] 2008年，中國共有790個(gè)醫(yī)院擁有關(guān)節(jié)鏡系統(tǒng)設(shè)施，可以實(shí)施關(guān)節(jié)鏡手術(shù)，這些醫(yī) 院主要集中在三甲醫(yī)院；到了 2012年，中國共有2640個(gè)醫(yī)院擁有關(guān)節(jié)鏡系統(tǒng)設(shè)施，可以實(shí) 施關(guān)節(jié)鏡手術(shù)，平均年增長率35%，覆蓋幾乎所有的三級醫(yī)院和約30%的二甲醫(yī)院。醫(yī)院 采購關(guān)節(jié)鏡系統(tǒng)的預(yù)算并未受到經(jīng)濟(jì)危機(jī)和中國經(jīng)濟(jì)減速的影響。在北京、上海等一些發(fā) 達(dá)城市其關(guān)節(jié)鏡技術(shù)水平已經(jīng)能夠和發(fā)達(dá)國家媲美。關(guān)節(jié)鏡手術(shù)已經(jīng)開始從城市三級醫(yī)院 轉(zhuǎn)向基層，適合我國國情，最大限度的覆蓋了人群。
[0005] 關(guān)節(jié)鏡手術(shù)可治療關(guān)節(jié)內(nèi)各種炎癥.如骨性關(guān)節(jié)炎滑膜炎、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)核性關(guān)節(jié)炎、化膿性關(guān)節(jié)炎，剝脫性骨軟骨炎等，以及滑膜軟骨瘤?。惑x骨軟 化癥；骨贅（骨刺），游離體，滑膜皺壁，關(guān)節(jié)紊亂癥，半月板損傷，關(guān)節(jié)囊粘連，各種關(guān)節(jié)內(nèi) 骨折，各部關(guān)節(jié)粘連及關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，各種不明原因的關(guān)節(jié)痛。
[0006] 關(guān)節(jié)鏡手術(shù)和關(guān)節(jié)切開術(shù)相比，具有下列優(yōu)點(diǎn)：切口小，美觀，可避免晚期因關(guān)節(jié) 表面和運(yùn)動(dòng)部位的瘢痕而引起的刺激癥狀；屬于微創(chuàng)手術(shù)，痛苦小，術(shù)后反應(yīng)較小，患者易 于接受；術(shù)后早期即可活動(dòng)和使用肢體，避免長期臥床并發(fā)癥，減少護(hù)理人員和費(fèi)用；并發(fā) 癥相對較少；基本不影響關(guān)節(jié)周圍肌肉結(jié)構(gòu)，術(shù)后可早期進(jìn)行功能鍛煉，防止關(guān)節(jié)長期固定 引起的廢用和并發(fā)癥；可以在近乎生理環(huán)境下對關(guān)節(jié)內(nèi)病變進(jìn)行觀察和檢查，有"把眼睛 和手指放入關(guān)節(jié)內(nèi)"之稱，可對關(guān)節(jié)進(jìn)行動(dòng)力性檢查，提高了診斷能力，某些疾病如滑膜皺 襞綜合征，是通過關(guān)節(jié)鏡才確立的；關(guān)節(jié)鏡可施行以往開放性手術(shù)難以完成的手術(shù)，如半月 板部分切除術(shù)等。禁忌癥少，如身體條件差不能行常規(guī)手術(shù)，但不一定禁忌關(guān)節(jié)鏡手術(shù)。
[0007] 關(guān)節(jié)鏡也具有一些缺點(diǎn)，一是并非每個(gè)醫(yī)生均有耐心進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)，因?yàn)樾杞?jīng) 小切口用精細(xì)和易損的器械進(jìn)行操作。二是在緊張的關(guān)節(jié)間隙內(nèi)操作器械可能對關(guān)節(jié)軟骨 產(chǎn)生明顯磨損和劃痕，尤其是沒有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生。三是在最初使用關(guān)節(jié)鏡操作時(shí)可能很費(fèi)時(shí) 間。四是專用器械繁雜而昂貴。
[0008][0009][0010][0011] 以上文獻(xiàn)資料表明，對關(guān)節(jié)各組織如軟骨組織、滑膜、滑液等，進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)時(shí) 所產(chǎn)生的大量沖洗液并沒有充分利用，在手術(shù)過程中直接丟棄，而手術(shù)所需的干細(xì)胞通過 其它方式獲得，雖然所獲得的干細(xì)胞排異低，還是會(huì)造成手術(shù)費(fèi)用較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：取經(jīng)關(guān)節(jié)鏡手術(shù)獲得大量來自關(guān)節(jié)各組織（軟骨組 織、滑膜、滑液）的間充質(zhì)干細(xì)胞液，采用分段收集、離心、膜過濾等程序，富集其中細(xì)胞成 分進(jìn)行培養(yǎng)與擴(kuò)增；富集的細(xì)胞經(jīng)過貼壁生長、增殖、分化以及外源微生物污染檢測等程序 后，參照國際ISCT推薦的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)對富集的干細(xì)胞純度和均一性的鑒定分析，最 后分別儲(chǔ)存于主細(xì)胞庫與工作細(xì)胞庫用于細(xì)胞治療。
[0013] 因此，本發(fā)明提供關(guān)節(jié)鏡沖洗液來源間充質(zhì)干細(xì)胞在再生修復(fù)中應(yīng)用，步驟包 括：
[0014] (1)關(guān)節(jié)液收集：用無菌的收集管對關(guān)節(jié)鏡手術(shù)過程中沖洗液進(jìn)行分段收集沖洗 液，保存?zhèn)溆茫?br>[0015] (2)將分段收集沖洗液在500g離心10~20min，所得細(xì)胞分別加入培養(yǎng)液后重新 懸浮，按3X IO5Ail濃度接種到培養(yǎng)瓶及事先放置有消毒蓋玻片的12孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)液 為含15% FBS的L-DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)5~7d去除未貼壁的細(xì)胞后，獲得貼壁細(xì)胞；
[0016] (3)合格供體材料檔案：參照國際間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)對貼壁細(xì)胞進(jìn)行純度和均一 性的鑒定分析，確定合格的間充質(zhì)干細(xì)胞，建立相關(guān)檔案，同時(shí)對合格的干細(xì)胞進(jìn)行傳代， 4~5d傳代一次；
[0017] (4)間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化：將培養(yǎng)傳代3次以上的干細(xì)胞，制成濃度為 4X 105/ml的懸液，取Iml細(xì)胞懸液于15ml塑料離心管中，500g離心15min，使其形成細(xì)胞微 團(tuán)，小心吸去培養(yǎng)液，加入2ml無血清軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，然后置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 天后首次換液，以后隔2天換液，在培養(yǎng)21天后取出培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)，檢測成軟骨分化效果；
[0018] (5)植入再生修復(fù)效果：將合格的間充質(zhì)干細(xì)胞按一定濃度植入患者關(guān)節(jié)處，觀 察關(guān)節(jié)再生修復(fù)效果。
[0019] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，步驟（1)所述保存條件是在無菌條件下，4°C儲(chǔ)存小于4 小時(shí)，運(yùn)輸過程中維持在4°C環(huán)境下。
[0020] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，步聚（2)和（4)中所述細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境條件為37°C、5% CO 2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0021] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，步聚⑷中所述無血清軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液是指高糖 DMEM(H-DMEM)含 TGF-β llng/mL、地塞米松 ΚΓ 7mmol/L、維生素 C 50mg/L，胰島素 6. 25ng/ L，轉(zhuǎn)鐵蛋白6. 25ug/mL，牛血清白蛋白I. 25ug/mL。
[0022] 所述間國際充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)是指參照國際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)（ISCT)推薦的間充質(zhì)干 細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)如 CD44、CD90、CD105、CD147、CD271、CD166 等。
[0023] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，步聚（5)中所述植入干細(xì)胞濃度在50~4X 107/ml。
[0024] 技術(shù)效果
[0025] 1、本發(fā)明充分利用丟棄的關(guān)節(jié)鏡沖洗液中的間充質(zhì)干細(xì)胞，用于針對關(guān)節(jié)軟骨病 變的再生修復(fù)治療。
[0026] 2、通過廢棄物再利用能獲得大量干細(xì)胞，這將大大滿足患者對干細(xì)胞的需要，也 減少了動(dòng)用患者其它部分干細(xì)胞的機(jī)率，免受二次手術(shù)傷害。
[0027] 3、通過大規(guī)模培養(yǎng)通過關(guān)節(jié)鏡沖洗液中的間充質(zhì)干細(xì)胞，能大大降低了患者的醫(yī) 療成本，提高了手術(shù)的成功率。
[0028] 4、該方法獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞分散性較好，不需要借助酶分離開，減少感染的機(jī) 率，也有利于間充質(zhì)干細(xì)胞的穩(wěn)定。
【附圖說明】
[0029] 圖1、培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞PO代光鏡下的形態(tài)圖；
[0030] 圖2、培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞Pl代光鏡下的形態(tài)圖；
[0031] 圖3、培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞P2代光鏡下的形態(tài)圖；
[0032] 圖4、培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞P3代光鏡下的形態(tài)圖；
[0033] 圖5、培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的阿爾新藍(lán)染色。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面，本發(fā)明將用實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的說明，但是它并不限于這些實(shí)施例的任一 個(gè)或類似實(shí)例。
[0035] 實(shí)施例1 :
[0036] 用無菌的收集管對關(guān)節(jié)鏡手術(shù)過程中沖洗液進(jìn)行分段收集沖洗液，在無菌條件 下，4°C儲(chǔ)存小于4小時(shí)，運(yùn)輸過程中維持在4°C環(huán)境下。將分段收集沖洗液在500g離心 10~20min，所得細(xì)胞分別加入培養(yǎng)液后重新懸浮，按3 X 105/ml濃度接種到培養(yǎng)瓶及事先 放置有消毒蓋玻片的12孔板中培養(yǎng)，37°C、5% CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培 養(yǎng)液為含15% FBS的L-DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)5~7d去除未貼壁的細(xì)胞后，獲得貼壁細(xì)胞。
[0037] 參照國際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)（ISCT)推薦的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)如⑶44、⑶90、⑶105、 ⑶147、⑶271、⑶166等，對貼壁細(xì)胞進(jìn)行純度和均一性的鑒定分析，確定合格的間充質(zhì)干細(xì) 胞，建立相關(guān)檔案，同時(shí)對合格的干細(xì)胞進(jìn)行傳代，4~5d傳代一次見圖1、2、3、4。
[0038] 成軟骨分化：將培養(yǎng)傳代3次以上的干細(xì)胞，制成濃度為4X IO5Ail的懸液，取 Iml細(xì)胞懸液于15ml塑料離心管中，500g離心15min，使其形成細(xì)胞微團(tuán)，小心吸去培 養(yǎng)液，加入2ml無血清軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，無血清軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液是指高糖DMEM(H-DMEM) 含TGF- β llng/mL、地塞米松10_ 7mmol/L、維生素C 50mg/L，胰島素6. 25ng/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白 6. 25ug/mL，牛血清白蛋白I. 25ug/mL。然后置于37°C、5% CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)，4天后首次換液，以后隔2天換液，在培養(yǎng)21天后取出培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)，檢測成軟骨分 化效果，見圖5。
[0039] 成骨分化：將培養(yǎng)傳代3次以上的干細(xì)胞，制成濃度為3 X 105/ml濃度接種到培養(yǎng) 瓶及事先放置有消毒蓋玻片的12孔板中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含15% FBS的L-DMEM培養(yǎng)液。 接種24h后，更換培養(yǎng)液并加入10 7mmol/L地塞米松，10ng/mL β -甘油磷酸鈉和50 μ g/mL 維生素C，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每2-3天用含新鮮的地塞米松、β -甘油磷酸鈉和維生素C 的L-DMEM換液。培養(yǎng)7、14、21天時(shí)檢測三向分化指標(biāo)。
[0040] 成脂肪分化：將培養(yǎng)傳代3次以上的干細(xì)胞，制成濃度為4Χ IO3個(gè)細(xì)胞/cm2的密 度接種于IOOmm平皿內(nèi)，加入含10 % FBS的無酚紅-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后換為成脂肪誘 導(dǎo)液（胰島素〇· 〇lmg/ml、0. 2mM吲哚美辛、0· 5mM ΙΒΜΧ、0· 2 μΜ地塞米松，10% FBS無酚紅 L-DMEM培養(yǎng)基），同時(shí)加入相應(yīng)試劑；每4d換