一種抗乙型肝炎病毒的肽核酸及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)與材料科學(xué)領(lǐng)域，涉及一種抗乙型肝炎病毒的肽核酸及其用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎病毒（HBV)是一種具有嗜肝性的、不引起細(xì)胞病變的DNA病毒。乙肝病 毒感染一直以來都是世界范圍內(nèi)重大的醫(yī)療健康問題。當(dāng)今全球仍有約3. 5~4億人受到 慢性乙肝的困擾。乙型肝炎病毒（HBV)的持續(xù)感染將使得病人罹患慢性活躍性肝炎、肝硬 化和肝細(xì)胞癌（HCC)的概率大幅上升。全球超過半數(shù)的肝臟癌癥都與乙肝病毒感染有關(guān)。
[0003] 當(dāng)今臨床上應(yīng)用于乙肝治療的主要是干擾素和核酸類似物類藥物。然而，由于干 擾素易產(chǎn)生毒副作用，而例如拉米夫定（3TC)等核酸類似物在臨床長期應(yīng)用中易引起耐藥 性。
[0004] 近年來，研發(fā)多種新型抗乙型肝炎藥物或活性物質(zhì)的研究相繼被報道，大多采用 選取新型藥物靶標(biāo)或降低藥物毒副作用等方法，以提升藥物的性能。然而，仍然沒有能夠完 美治療乙肝病毒（HBV)感染的藥物問世。設(shè)計、開發(fā)和研究新型抗乙肝藥物仍然十分重要 而急迫。
[0005] 肽核酸（PNA)是一種人工合成的多聚物，通常被以配對結(jié)合靶標(biāo)的方法應(yīng)用于疾 病治療或用于臨床分子診斷。肽核酸（PNA)是具有人工合成骨架的核酸類似物。然而，由 于其骨架呈電中性且柔韌性極強，肽核酸表現(xiàn)出與DNA或RNA分子很高的結(jié)合力和特異性， 且極難被核酸酶和蛋白酶識別和降解。因此具有較長的半衰期。另外，肽核酸（PNA)分子 往往毒性很低，有較大的應(yīng)用潛力。材料學(xué)上，為了使一種材料分子能夠?qū)崿F(xiàn)更多功能，常 常將肽核酸（PNA)與一些其他功能基團(tuán)進(jìn)行螯合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗乙型肝炎病毒的肽核酸。本發(fā)明的另一目的在于提 供一種抗乙型肝炎病毒的肽核酸復(fù)合體。本發(fā)明的再一目的在于提供上述肽核酸、肽核酸 復(fù)合體的用途。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008] -種抗乙型肝炎病毒的肽核酸，其核酸序列為5 ' -GCAGAGGTGAA-3 '（SEQ ID NO. 1) 〇
[0009] -種抗乙型肝炎病毒的肽核酸復(fù)合體，為在上述肽核酸上螯合了細(xì)胞穿膜肽。所 述的細(xì)胞穿膜肽優(yōu)選為Tat (GRKKRRQRRRPPGC，SEQ ID NO. 2)，細(xì)胞穿膜肽為Tat時，該肽核 酸復(fù)合體的氨基酸與核酸序列為：NH2-GRKKRRQRRRPPGC-MPA-GCAGAGGTGAA-3'，MPA為3-馬 來酰亞胺基丙酸基團(tuán)。
[0010] 上述肽核酸或肽核酸復(fù)合體在制備抗乙型肝炎病毒的藥物中的應(yīng)用。
[0011] 上述肽核酸或肽核酸復(fù)合體在制備治療和/或預(yù)防乙型肝炎的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果：
[0013] (1)本發(fā)明的肽核酸和肽核酸復(fù)合體含有11個堿基，生產(chǎn)方法簡便，無細(xì)胞毒性， 水溶性較好。
[0014] (2)本發(fā)明的肽核酸和肽核酸復(fù)合體抗病毒活性高，能自主穿透細(xì)胞膜進(jìn)入被 HBV感染的細(xì)胞，對HBV的復(fù)制有明顯的抑制作用，當(dāng)其濃度在1 μΜ左右時對HBV的抑制 率就可以達(dá)到50 %，其具有抑制乙肝病毒感染的功能，抑制效果顯著，對肝臟細(xì)胞無毒副作 用。與現(xiàn)有的抗病毒藥物相比，本發(fā)明的肽核酸復(fù)合體具有更加直接而且有效的作用。
【附圖說明】
[0015] 圖1是Tat-PNA-DR的設(shè)計與合成流程圖。
[0016] 圖2是PNA-DR的質(zhì)譜鑒定圖。
[0017] 圖3是HPLC分離純化Tat-PNA-DR的結(jié)果圖。
[0018] 圖4是HPLC分離純化后的Tat-PNA-DR質(zhì)譜分析圖。
[0019] 圖5是不同濃度Tat-PNA-DR對H印G2. 2. 15細(xì)胞毒性檢測柱狀結(jié)果圖。
[0020] 圖6是不同濃度Tat-PNA-DR對H印G2. 2. 15細(xì)胞系上清中HBV e抗原濃度影響 的結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為Tat-PNA-DR的濃度（μ M)，縱坐標(biāo)為相應(yīng)濃度的Tat-PNA-DR處理后病 毒蛋白的量，以不添加 Tat-PNA-DR(即Tat-PNA-DR濃度為0 μ Μ)的實驗組的蛋白量作為 100%〇
[0021] 圖7是不同濃度Tat-PNA-DR對H印G2. 2. 15細(xì)胞系上清中HBV s抗原濃度影響 的結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為Tat-PNA-DR的濃度（μ Μ)，縱坐標(biāo)為相應(yīng)濃度的Tat-PNA-DR處理后病 毒蛋白的量，以不添加 Tat-PNA-DR(即Tat-PNA-DR濃度為0 μ Μ)的實驗組的蛋白量作為 100%〇
[0022] 圖8是Tat-PNA-DR在HBV小鼠急性感染模型中對HBV e抗原抑制效果的結(jié)果圖， 橫坐標(biāo)為實驗動物不同處理方式的分組，縱坐標(biāo)為小鼠血清中e抗原的濃度。
[0023] 圖9是Tat-PNA-DR在HBV小鼠急性感染模型中對HBV s抗原抑制效果的結(jié)果圖， 橫坐標(biāo)為實驗動物不同處理方式的分組，縱坐標(biāo)為小鼠血清中s抗原的濃度。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此， 其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為 等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0025] 實施例1抗HBV肽核酸復(fù)合體Tat-PNA-DR的制備
[0026] 本發(fā)明抗HBV肽核酸復(fù)合體的設(shè)計與合成流程見圖1。首先尋找到HBV前基因組 RNA上的一段核酸區(qū)域DR1，其序列為：5' -UUCACXUCUGC-3'。根據(jù)DRl的核酸序列，設(shè)計與 之互補配對的肽核酸PNA-DR，PNA-DR序列為5'-MPA-GCAGAGGTGAA-3'。為使該肽核酸具有 自主穿透細(xì)胞膜的能力，再將PNA-DR與細(xì)胞穿膜肽Tat(GRKKRRQRRRPPGC，SEQ ID NO. 2)進(jìn) 行螯合即得到抗HBV肽核酸復(fù)合體Tat-PNA-DR，其氨基酸與核酸序列為：nh2-grkkrrqrrrp PGC-MPA-GCAGAGGTGAA-3'，MPA為3-馬來酰亞胺基丙酸基團(tuán)。Tat-PNA-DR的具體制備過程 如下：
[0027] A :與靶標(biāo)序列DRl互補的PNA-DR合成
[0028] 使用固相合成的方法人工合成PNA低聚物，并以芴甲氧羰基/二苯甲羰基保護(hù)PNA 單體。在Rink Amide-AM樹脂上逐個加成PNA鏈。PNA單體以重復(fù)的去荷甲氧羰基反應(yīng)被 加成。當(dāng)PNA單體在甲基吡咯烷酮（NMP)溶液（4當(dāng)量PNA單體，3. 6當(dāng)量HATU (2-(7-偶氮 苯并三氮唑）-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯），8當(dāng)量NMM(甲基嗎啉））中耦合時，哌啶 二甲基甲酰胺（DMF)溶液（20%，v/v)被用來去除芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)，在DMF中的乙酸酐 和2, 6-盧剔啶混合物被用來加帽。當(dāng)所有步驟完成后，用DMF清洗樹脂4次，以去除殘留 的反應(yīng)物。ΜΡΑ(3-馬來酰亞胺基丙酸）基團(tuán)以同樣的方式連接在最末端。當(dāng)所有偶聯(lián)反應(yīng) 都完成后，用DMF、甲醇和二氯甲烷清洗樹脂3次并真空干燥。然后，使用TFA、間甲酚和水 的混合物（95:3:2, v/v/ν)處理2小時，將PNA鏈完全去保護(hù)并解離，以從樹脂上分離。用 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法將反應(yīng)產(chǎn)物過濾和濃縮，然后以過量冰乙醚沉淀。將沉淀離心并真空干燥。 用Axima T0F2質(zhì)譜儀（Shimadzu, Kyoto, Japan)進(jìn)行MALDI-T0F質(zhì)譜鑒定并確證產(chǎn)物正確 (圖 2)。
[0029] B =PNA-DR與細(xì)胞穿膜肽Tat的螯合
[0030] 從GL Biochem Inc.公司（Shanghai, China)購買Tat 多肽（GRKKRRQRRRPPGC-OH)。 在Tat C末端設(shè)計半胱氨酸殘基以使之能與PNA序列上的馬來酰亞胺基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，生成 Tat-PNA-DR復(fù)合體。以摩爾比1:2的比例將MPA-PNA與Tat溶于蒸餾水并于穩(wěn)定的氮氣 流下攪拌2天以保證其厭氧條件。該溶液首先以透析袋（分子量2000)進(jìn)行透析純化。然 后，以高效液相色譜（HPLC)進(jìn)行進(jìn)一步分離純化（圖3)。HPLC顯示的每一個主峰都進(jìn)行 收集，并以質(zhì)譜進(jìn)行鑒定（圖4)，確定所需產(chǎn)物的出峰位置。將正確的峰所收集到的溶液進(jìn) 行冷凍干燥，以獲得高純度（純度達(dá)95%以上）的最終產(chǎn)物Tat-PNA-DR。
[0031 ] 實施例2肽核酸復(fù)合體Tat-PNA-DR細(xì)胞毒性的檢測
[0032] 1、材料：!fepG2· 2. 15細(xì)胞的培養(yǎng)
[0033] !fepG2. 2. 15細(xì)胞系，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0034] DMEM 培養(yǎng)基：10 % 小牛血清（FCS，GIBC0-BRL)，100U/mL 青霉素和 100 μ g/mL 鏈霉 素。
[0035] 培養(yǎng)條件：37 °C，5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0036] 2、具體操作方法：
[0037] MTT(3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽）是一種染料，MTT實驗是 檢測細(xì)胞生長和存活的實驗方法。其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能還原MTT， 使其變成藍(lán)紫色的結(jié)晶甲瓚，并在細(xì)胞中積累；而死亡的細(xì)胞則無此功能。加入DMSO后，能 夠溶解細(xì)胞中形成的甲瓚。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定570nm的光吸收，能反映出活細(xì)胞數(shù)量。 具體步驟如下：
[0038] (1)收集對數(shù)期IfepG2. 2. 15細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)成一定濃度的細(xì)胞懸液鋪96 孔板，每孔加180 μ L，最終細(xì)胞密度為約IO4個/孔。
[0039] (2)然后每孔加入20 μ L含不同濃度Tat-PNA-DR的培養(yǎng)基，使Tat-PNA-DR的終濃 度分別為 100 μΜ、50 μΜ、25 μΜ、12· 5 μΜ、6· 25 μΜ、3· 13 μΜ、1· 56 μΜ、0· 78 μΜ 和 0 μΜ，每 個濃度5個復(fù)孔。加入Tat-PNA