一種連香樹基因組dna的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種連香樹基因組DNA的提取方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]頑拗類植物是指由于特殊細(xì)胞結(jié)構(gòu)和高含量次生產(chǎn)物而使得基因組DNA的提取非常困難的一類植物，其中的次生產(chǎn)物主要包括多糖、多酚、蛋白質(zhì)以及其他一些未知的粘性極強(qiáng)的化合物，提取DNA時(shí)，它們通常與核基因組DNA共同沉淀或者捆綁在一起，嚴(yán)重地影響了 DNA質(zhì)量，導(dǎo)致擴(kuò)增、酶切等分子操作難以進(jìn)行。有許多林木樹種屬于這類植物，瀕危植物連香樹就是其中的一種。
[0003]連香樹(Cercidiphyllum japonicum)為連香樹科連香樹屬植物，是第三紀(jì)古熱帶植物的孑遺種單型科植物，也是較古老原始的木本植物，為國(guó)家二級(jí)瀕危保護(hù)植物，在系統(tǒng)演化中處于比較原始的地位，分布于山西南部、河南西南部、陜西南部、甘肅南部、安徽西部、浙江北部、江西北部和東部、湖北西部、四川西部和東南部等局部地區(qū)，生于海拔400-2500m的常綠和落葉闊葉混交林中，是重要的藥用植物和園林綠化植物。連香樹組織中含有較多的單寧、酚類、多糖及色素等成分，如果DNA提取方法不當(dāng)，會(huì)使提取出的基因組DNA進(jìn)入這種粘稠膠狀物中而難于溶解，影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行連香樹種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，揭示其遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)狀況，對(duì)于高效建立連香樹種質(zhì)資源基因庫、連香樹遺傳育種以及連香樹種質(zhì)資源的進(jìn)一步保護(hù)和開發(fā)利用具有重要的指導(dǎo)意義。
[0004]基因組DNA的提取是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，常用的基因組DNA提取方法有:CTAB法、SDS法、高鹽低pH法、PVP法、尿素法等。采用上述幾種方法提取連香樹基因組DNA時(shí)都出現(xiàn)研磨樣加入提取液后變得粘稠，提取的DNA樣品由于含有大量的次生物不易溶于TE緩沖液，其中的粘性物致使DNA檢測(cè)以及PCR擴(kuò)增時(shí)上樣困難、電泳困難，凝膠電泳檢測(cè)和PCR擴(kuò)增檢測(cè)顯示DNA得率低，上樣孔或樣道非常亮或無亮帶、擴(kuò)增樣帶少或無擴(kuò)增亮帶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種連香樹基因組DNA的提取方法，該方法提取效果好、純度高，操作簡(jiǎn)單。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的一種連香樹基因組DNA的提取方法，包括以下步驟:
[0007]I)取30?50mg的連香樹葉片，液氮研磨，研磨過程中加入I?2.5mg的PVP40、I?2.5mg的抗壞血酸鈉和I?2mg的石英砂，研磨均勻后得粉末A，將粉末A加入到經(jīng)65°C預(yù)熱的700 μ L提取緩沖液中，再加入100 μ L β -巰基乙醇，振蕩混勻得混合液B，混合液B于65°C恒溫水浴I?1.5h，其間晃動(dòng)3?4次；
[0008]2)向混合液B中加入其體積1/3倍的濃度為5mol/L、pH為4.8的KAC溶液得混合液C，將混合液C置于-20°C冰浴0.5?lh，離心得上清液Cl ;
[0009]3)向上清液Cl中加入其體積1/5倍的2 X CTAB提取緩沖液，混勻得混合液D，混合液D于65°C恒溫水浴10?20min，冷卻至室溫后，加入與混合液D等體積的24: I的氯仿-異戊醇溶液得混合液E，離心得上清液El ；
[0010]4)向上清液El中加入與上清液El等體積的24: I的氯仿-異戊醇溶液得混合液，離心得上清液E2 ;
[0011]5)向上清液E2中加入與上清液E2等體積的24: I的氯仿-異戊醇溶液得混合液，離心得上清液E3 ;
[0012]6)向上清液E3中加入其體積1/2倍的高鹽溶液和上清液E3體積1/2倍的經(jīng)-20°C預(yù)冷的異丙醇，混勻得混合液F，混合液F在_20°C放置0.5?lh，離心得沉淀物Fl ；
[0013]7)將沉淀物Fl用濃度為70%乙醇洗滌，風(fēng)干沉淀物F1，再向沉淀物Fl中加500 μ L滅菌水溶解，再加入溶解沉淀物Fl體積1/10倍的濃度為3mol/L、pH為5.2的NaAC溶液及溶解沉淀物Fl體積2倍的無水乙醇，混勻得混合液G，離心得沉淀物Gl ;
[0014]8)沉淀物Gl用濃度為70%乙醇洗滌2次，再用濃度為100%乙醇洗滌I次，自然風(fēng)干，風(fēng)干后的沉淀物Gl中加入0.1 X TE溶液溶解后即為連香樹基因組DNA溶液。
[0015]作為改進(jìn)，所述步驟I)中提取緩沖液包括濃度為100mmol/L、pH為8.0的Tris-HCl，濃度為 50mmol/L、pH 為 8.0 的 EDTA，濃度為 1.0mol/L 的 NaCl，2 % SDS 及 2 %PVP40。
[0016]作為改進(jìn)，所述步驟2)、3)、4)、5)、6)、7)中的離心條件為4°C，轉(zhuǎn)速為12000r/min離心1min。
[0017]作為改進(jìn)，所述步驟3)中2 X CTAB提取緩沖液包括濃度為100mmol/L、pH為8.0的 Tris-HCl，濃度為 20mmol/L、pH 為 8.0 的 EDTA，濃度為 1.4mol/L 的 NaCl，及 2% CTAB0
[0018]作為改進(jìn)，所述步驟6)中高鹽溶液包括0.8mol/L的檸檬酸鈉和1.2mol/L的NaCl0
[0019]作為改進(jìn)，所述步驟8)中0.1XTE溶液包括濃度為1.0mmOl/L、pH為8.0的Tris-HCl，濃度為 0.lmmol/L、pH 為 8.0 的 EDTA。
[0020]作為改進(jìn)，該方法具體包括以下步驟:
[0021]I)取40mg的干樣連香樹葉片，液氮研磨，研磨過程中加入2mg的PVP40、2mg的抗壞血酸鈉和1.5mg的石英砂，研磨均勻后得粉末A，將粉末A加入到經(jīng)65°C預(yù)熱的700 μ L提取緩沖液中，再加入100 μ L β -巰基乙醇，振蕩混勻得混合液B，混合液B于65°C恒溫水浴I?1.5h，其間晃動(dòng)3?4次；
[0022]2)向混合液B中加入其體積1/3倍的濃度為5mol/L、pH為4.8的KAC溶液得混合液C，將混合液C置于-20°C冰浴0.5?lh，離心得上清液Cl ;
[0023]3)向上清液Cl中加入其體積1/5倍的2 X CTAB提取緩沖液，混勻得混合液D，混合液D于65°C恒溫水浴10?20min，冷卻至室溫后，加入與混合液D等體積的24: I的氯仿-異戊醇溶液得混合液E，離心得上清液El ；
[0024]4)向上清液El中加入與上清液El等體積的24: I的氯仿-異戊醇溶液得混合液，離心得上清液E2 ;
[0025]5)向上清液E2中加入與上清液E2等體積的24: I的氯仿-異戊醇溶液得混合液，離心得上清液E3 ;
[0026]6)向上清液E3中加入其體積1/2倍的高鹽溶液和上清液E3體積1/2倍的經(jīng)-20°C預(yù)冷的異丙醇，混勻得混合液F，混合液F在_20°C放置0.5?lh，離心得沉淀物Fl ；
[0027]7)將沉淀物Fl用濃度為70%乙醇洗滌2次，風(fēng)干沉淀物Fl，再向沉淀物Fl中加500 μ L滅菌水溶解，再加入溶解沉淀物Fl體積1/10倍的濃度為3mol/L、pH為5.2的NaAC溶液及溶解沉淀物Fl體積2倍的無水乙醇，混勻得混合液G，離心得沉淀物Gl ;
[0028]8)沉淀物Gl用濃度為70 %乙醇洗滌2次，再用濃度為100 %乙醇洗滌I次，自然風(fēng)干，風(fēng)干后的沉淀物Gl中加入50 μ L 0.1 X TE溶液溶解后即為連香樹基因組DNA溶液。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0030](I)與傳統(tǒng)的CTAB法、SDS法和PVP法相比，本發(fā)明的提取方法在研磨時(shí)不需加DICA (二乙二硫氨甲酸)，而是加入PVP40和少量的抗壞血酸鈉，可以通過PVP40與酚類物質(zhì)結(jié)合形成鰲合物，通過離心除去后可提高DNA的得率和純度。用PVP40和抗壞血酸鈉，是利用其“C0-N = ”基隨多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強(qiáng)的結(jié)合多酚化合物能力，其結(jié)合成復(fù)合物后，可通過離心操作除去。
[0031](2)本發(fā)明的提取方法采用β-Mercaptoethanol ( β-巰基乙醇)的用量增加了一倍，加入β -Mercaptoethanol主要是利用其“_SH”基打斷多酸氧化物酶的二硫鍵而使之失活，防止酚類化合物被氧化而不被形成復(fù)合物，有利于離心除去酚類物質(zhì)。因此適當(dāng)?shù)靥岣擀?-巰基乙醇的含量能有效除去酚類、多糖等次生物質(zhì)。
[0032](3)本發(fā)明方法采用2 X CTAB (十六烷基-三甲基溴化銨)，而不使用傳統(tǒng)方法中的 10% 的 CTAB Buffer (10mmoI/L Tris-HCl，pH 8.0 ；50mmol/L EDTA, pH 8.0 ；1.0mol/LNaCl ；10% CTAB);通過加入異丙醇后于_20°C冰浴0.5_lh，再經(jīng)低溫離心，可有效提高DNA的提取效率和純度。
[0033](4)在沉淀DNA時(shí)采用加入高鹽溶液和NaAC溶液，可以有效去除糖類，防止其在RAPD反應(yīng)中抑制Taq酶活性。
[0034](5)本發(fā)明綜合了 CTAB法、