抑制植物病原真菌的重組利迪鏈霉菌的構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中抑制植物病原真菌的重組利迪鏈霉菌的構(gòu)建方法與 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國是以種植業(yè)為基礎(chǔ)的農(nóng)業(yè)大國，許多重大病害，如灰霉病、炭疽病、番茄葉霉 病、西瓜枯萎病、小麥赤霉病等對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重損失（陳軍等，2010)。每年通過使用 農(nóng)藥可減少經(jīng)濟損失達300億元左右，但是化學(xué)防治起主要作用，化學(xué)農(nóng)藥施用量占農(nóng)藥 用量的80%以上，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、抗性增加等，嚴(yán)重威脅著人類的健康和 生態(tài)環(huán)境。因此，生物防治是農(nóng)藥發(fā)展的必然趨勢，由于微生物及其代謝產(chǎn)物具有高度專一 性，殺蟲效率高，不殺傷天敵，且容易降解，無殘留，對人畜無毒，能增強植物的抗病性，刺激 植物生長，同時能夠有效緩解化學(xué)農(nóng)藥帶來的抗藥性等（黃定高，2010)。近幾年微生物農(nóng) 藥在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用，已經(jīng)產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益、社會效益和生態(tài)效益，目前已被很多 國家列入國家重點科研規(guī)劃。
[0003] 根據(jù)用途和防治對象的不同，用于生物防治的微生物種類也很多樣，其中鏈霉菌 由于次生代謝產(chǎn)物豐富而廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生物防治中。但是，作為天然菌株，單一菌株的代 謝產(chǎn)物種類有限，就會出現(xiàn)抑菌機制單一，抑菌能力差，抑菌譜窄等現(xiàn)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高利迪鏈霉菌對植物病原真菌的抗菌活性。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了構(gòu)建重組利迪鏈霉菌的方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的構(gòu)建重組利迪鏈霉菌的方法，包括將蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胱鳛?宿主菌的利迪鏈霉菌中，得到重組利迪鏈霉菌的步驟；
[0007]將所述蛋白質(zhì)的命名為RFRP，RFRP是下述的a)或b):
[0008] a)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 1的蛋白質(zhì)；
[0009] b)將序列表中SEQ ID No. 1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。
[0010] 為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中SEQ ID No. 1所示的蛋白質(zhì)的氨基 末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0011] 表1、標(biāo)簽的序列
[0012]
[0013]

[0014] 上述b)中的蛋白質(zhì)均可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得 到。上述b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將SEQ ID No. 2的第14-1618位核苷酸所示的 DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突 變得到。
[0015] 上述方法中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因為如下al)或a2)或a3)或a4)所示的基因：
[0016] al)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 2的cDNA分子或DNA分子；
[0017] a2)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 2的第14-1618位的cDNA分子或DNA分 子；
[0018] a3)與al)或a2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼氨基酸 序列為SEQ ID No. 1的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0019] a4)在嚴(yán)格條件下與al)或a2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼氨基酸序列為SEQ ID No. 1的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。
[0020] 其中，SEQ ID No. 2由1626個核苷酸組成，SEQ ID No. 2的第8-13位核苷酸為 Nde I的識別位點，SEQ ID No. 2的第14-1618位核苷酸編碼SEQ ID No. 1的蛋白質(zhì)，SEQ ID No. 2的第1619-1624位核苷酸為EcoR I的識別位點。
[0021 ] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本 發(fā)明的編碼SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75%或更高， 或85 %或更高，或90 %或更高，或95 %或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或 計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比（％) 表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0022] 上述方法中，所述嚴(yán)格條件是在2XSSC，0. 1 % SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗 膜2次，每次5min，又于0. 5XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次 15min〇
[0023] 上述75%或75%以上同一性，可為80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0024] 上述方法中，將所述蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胱鳛樗拗骶睦湘溍咕袨閷?所述RFRP的編碼基因的表達載體導(dǎo)入所述作為宿主菌的利迪鏈霉菌中。
[0025] 上述方法中，所述將蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胱鳛樗拗骶睦湘溍咕ㄈ缦虏?驟：將所述表達載體導(dǎo)入大腸桿菌中得到重組大腸桿菌，再將所述重組大腸桿菌與所述作 為宿主菌的利迪鏈霉菌進行雙親接合獲得重組利迪鏈霉菌。
[0026] 在本發(fā)明的實施例中，所述表達載體的構(gòu)建步驟包括：用SEQ ID No. 2的第 14-1618位核苷酸所示的DNA分子替換pIB139中的Nde I和EcoR I識別序列間的DNA片段 得到的重組載體PIB139-RFRP。所述pIB139-RFRP中，RFRP基因的表達由所述pIB139-RFRP 中的紅霉素啟動子（ermE*)啟動，表達SEQ ID No. 1的所示的蛋白質(zhì)。所述pIB139-RFRP 即為包含所述RFRP的編碼基因的表達載體。
[0027] 上述方法中，所述作為宿主菌的利迪鏈霉菌可為保藏編號為CGMCC 1^〇.1653的利迪鏈霉菌（51:代。1:〇1115^68 17(1;[(3118)401。所述大腸桿菌可為去甲基化 E. coliET12567(pUZ8002)0
[0028] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了重組利迪鏈霉菌。
[0029] 本發(fā)明所提供的重組利迪鏈霉菌，為由所述方法得到的重組利迪鏈霉菌。
[0030] 上述重組利迪鏈霉菌中，所述重組利迪鏈霉菌可為含有SEQ IDNo.2的第14-1618 位核苷酸所示的DNA片段的重組利迪鏈霉菌。所述重組利迪鏈霉菌具體可為含有所述 PIB139-RFRP的重組利迪鏈霉菌。
[0031] 上述重組利迪鏈霉菌中，所述重組利迪鏈霉菌的菌株號為AB01，其在中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 10707。
[0032] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述HI或H2的產(chǎn)品：
[0033] HURFRP；
[0034] H2、與RFRP相關(guān)的生物材料，為下述A1)至A20)中的任一種：
[0035] A1)編碼RFRP的核酸分子；
[0036] A2)含有A1)所述核酸分子的表達盒；
[0037] A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；
[0038] A4)含有A2)所述表達盒的重組載體；
[0039] A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；
[0040] A6)含有A2)所述表達盒的重組微生物；
[0041] A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；
[0042] A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；
[0043] A9)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物或動物細胞系；
[0044] A10)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物或動物細胞系；
[0045] All)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物或動物細胞系；
[0046] A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物或動物細胞系；
[0047] A13)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物或動物組織；
[0048] A14)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物或動物組織；
[0049] A15)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物或動物組織；
[0050] A16)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物或動物組織；
[0051] A17)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物或動物器官；
[0052] A18)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物或動物器官；
[0053] A19)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物或動物器官；
[0054] A20)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物或動物器官。
[0055] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也 可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0056]本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方 法，對本發(fā)明的編碼RFRP的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分 離得到的RFRP的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要編碼RFRP且具有相同功 能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0057] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相