一種甘蔗無(wú)載體框架轉(zhuǎn)基因方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及技術(shù)領(lǐng)域涉及植物遺傳轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，具體涉及甘蔗無(wú)載體框架轉(zhuǎn)基因方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物遺傳轉(zhuǎn)化是研究外源目的基因功能和開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因植物的有效途徑，是開(kāi)展植 物學(xué)研究的基礎(chǔ)手段之一。近年來(lái)，隨著轉(zhuǎn)基因植物的商業(yè)化種植，轉(zhuǎn)基因作物品種和種植 面積逐年增加，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益。但是，消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的安全性要 求也越來(lái)越高，轉(zhuǎn)化背景簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)基因植物和高效快速的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是研究的發(fā)展趨勢(shì)。
[0003] 甘蔗是一種重要的糖料經(jīng)濟(jì)作物，廣泛種植于熱帶、亞熱帶地區(qū)，甘蔗糖占全球食 糖總量的70%以上。同時(shí)，甘蔗具有高光合效率、高生物產(chǎn)量的特點(diǎn)，是生產(chǎn)乙醇的最佳能 源作物。甘蔗屬于日中性植物，開(kāi)花難，同時(shí)甘蔗在生產(chǎn)上通過(guò)無(wú)性繁殖，相比其它轉(zhuǎn)基因 甘蔗具有較高的生物安全性，屬于轉(zhuǎn)基因安全I(xiàn)類植物，具有良好的商業(yè)化種植前景。
[0004] 基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因研究，具有適應(yīng)性廣，效率高的 特點(diǎn)。目前常規(guī)的甘蔗轉(zhuǎn)基因所用的外源基因材料多為含有目的基因的載體，這導(dǎo)致大量 載體序列也插入到甘蔗基因組中，導(dǎo)致效率低下，同時(shí)也導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因甘蔗的遺傳背景較為 復(fù)雜。特別是目前甘蔗基因組還沒(méi)有完成，導(dǎo)致確定目的基因的插入位點(diǎn)無(wú)法完成。目前有 通過(guò)如pCambial300系列載體將外源基因?qū)敫收岬姆椒▓?bào)道，如專利CN201210462236. 8 公開(kāi)的一種抗螟蟲（BT)和抗除草劑（Bar)共價(jià)外源基團(tuán)導(dǎo)入甘蔗的方法，由于基因槍轉(zhuǎn)化 是隨機(jī)的，避免了載體序列的插入，導(dǎo)致插入片段的隨機(jī)性和復(fù)雜性，造成轉(zhuǎn)化效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種無(wú)載體框架的甘蔗無(wú)載體框 架轉(zhuǎn)基因方法，可利用該方法獲得一種轉(zhuǎn)基因甘蔗。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種甘蔗無(wú)載體框架轉(zhuǎn)基因方法，包括以下步驟：
[0008] 1)質(zhì)粒提?。簩?duì)含有bar基因的大腸桿菌單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取含有bar基因的 質(zhì)粒；
[0009] 2)Bar基因表達(dá)盒的制備：采用核酸內(nèi)切酶Hind III和Xho I酶切步驟1)獲得的 含有bar基因的質(zhì)粒，得酶切產(chǎn)物；將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳純化，收集含有啟動(dòng)子、bar基因和 終止子的Bar基因表達(dá)盒；
[0010] 3)基因槍轉(zhuǎn)化：將步驟2)獲得的Bar基因表達(dá)盒制備DNA微彈，用裝載有DNA微 彈的基因槍轟擊甘蔗愈傷組織，對(duì)轟擊后的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)；
[0011] 4)抗性篩選：使用除草劑進(jìn)行抗性篩選，再生培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因植株。
[0012] 作為優(yōu)選，步驟2)中，取步驟1)獲得的含有bar基因的質(zhì)粒，每lOiig質(zhì)粒加入 10*buffer 10yL、HindIII酶 2yL 和Xho I 酶2yL，加入雙蒸水定容至 100yL，37°C 過(guò)夜， 得酶切產(chǎn)物。
[0013] 作為優(yōu)選，步驟2)中以瓊脂糖凝膠為凝膠介質(zhì)，以核酸電泳緩沖液10XTAE Buffer為電泳緩沖液，進(jìn)行電泳純化。
[0014] 作為優(yōu)選，步驟3)中，使bar基因沉淀到金粉微粒載體上，制備金粉懸浮液，轉(zhuǎn)移 至載物膜上，制得DNA微彈。
[0015] 作為優(yōu)選，步驟3)中，轟擊條件為：基因槍樣品室的真空度為20mM Pa，轟擊壓力 位llOOpsi，射程為9cm，轟擊1次。
[0016] 作為優(yōu)選，步驟3)中，愈傷組織采用高滲培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，所述高滲培養(yǎng)基為含 有 0.2mol/L Sorbitol 和 0.2mol/L Mannitol、lmg/L 2,4-D 和 5.5g/L 瓊脂粉的 MS 培養(yǎng)基。
[0017] 作為優(yōu)選，步驟4)中，采用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，所述選擇培養(yǎng)基為含有 3mg/L2, 4 一 D、5mg/L草丁膦、5. 5g/L瓊脂粉的MS培養(yǎng)基，所述選擇培養(yǎng)基的pH值為5. 8。
[0018] 作為優(yōu)選，步驟4)中，使用分化培養(yǎng)基后和生根培養(yǎng)基進(jìn)行再生培養(yǎng)，所述分化 培養(yǎng)基為含有3mg/L 6-BA、5mg/L草丁膦、5. Og/L瓊脂粉的MS培養(yǎng)基，所述分化培養(yǎng)基的 pH值為5. 8 ;所述生根培養(yǎng)基為含有3mg/L NAA、5mg/L草丁膦、5. 0g/L瓊脂粉的MS培養(yǎng)基， 所述生根培養(yǎng)基的pH值為5. 8。
[0019] 作為優(yōu)選，步驟4)后，還包括一 PCR檢測(cè)步驟，采用如下引物序列：
[0020] 上游引物 SEQ ID No. 1 :5,-ACCATCGTCAACCACTACAT-3' ；
[0021] 下游引物 SEQ ID No. 2 :5' -AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。
[0022] 作為優(yōu)選，PCR 檢測(cè)反應(yīng)體系：模板 DNA 50-100ng，lOXBuffer 1. 5 y L，lOmmol/ L dNTP 0? 35 y L, lOmmol/L 上游引物 0? 35 y L, lOmmol/L 下游引物 0? 35 y L, 25mmol/L MgC121. 0 y L, Taq 酶（5U/ y L) 0? 2 y L,加 ddH20 至 15 y L ;
[0023] PCR 反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性 3min ;95°C 30sec, 60°C 40sec, 72°C 40sec, 35 個(gè)循環(huán)； 72°C 延伸 10min，4°C 保存。
[0024] 本發(fā)明相比起現(xiàn)在有技術(shù)，有以下技術(shù)效果：
[0025] 1.本發(fā)明采用含有目的基因的表達(dá)盒，去掉無(wú)用的載體序列直接采用目的外源基 因轉(zhuǎn)入甘蔗受體，減少無(wú)用序列插入的機(jī)會(huì)，提高了目的基因的插入改良，有效提高了轉(zhuǎn)化 效率；
[0026]2.本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因方法，外源基因的背景清晰，更有利于插入位點(diǎn)的確定，轉(zhuǎn) 基因過(guò)程更加可控；
[0027] 3.本發(fā)明制備了 Bar基因的表達(dá)盒，利用基因槍對(duì)甘蔗進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得了含有Bar 的抗除草劑轉(zhuǎn)基因甘蔗，提供了一種更加經(jīng)濟(jì)可行的獲得抗除草劑甘蔗的轉(zhuǎn)基因方法；
[0028] 4.本發(fā)明提供的甘蔗無(wú)載體框架轉(zhuǎn)基因方法，操作方便，不需要操作人員掌握大 量的操作技能，適合大規(guī)模的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因甘蔗的批量生產(chǎn)；
[0029] 5.本發(fā)明提供的甘蔗無(wú)載體框架轉(zhuǎn)基因方法，不僅適用于將Bar基因?qū)敫收嶂?株，還適用于將其它除草劑基因?qū)敫收嶂仓辍?br>[0030] 下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1為Bar基因表達(dá)盒不意圖；
[0032] 圖2為酶切產(chǎn)物電泳圖；
[0033] 圖3為基因槍轉(zhuǎn)化后的愈傷組織圖；
[0034] 圖4為再生植株；
[0035] 圖5為移栽成活的轉(zhuǎn)基因植株；
[0036] 圖6為再生植株的PCR檢測(cè)電泳圖，其中1號(hào)為陽(yáng)性對(duì)照；2號(hào)為陰性對(duì)照；3-25 號(hào)為轉(zhuǎn)基因植株。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 以下【具體實(shí)施方式】中，所用試劑或儀器如無(wú)特殊說(shuō)明，均視為市售。
[0038] 本發(fā)明提供一種甘蔗無(wú)載體框架轉(zhuǎn)基因方法，包括以下步驟：
[0039] 1)質(zhì)粒提取：對(duì)含有bar基因的大腸桿菌單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取含有bar基因的 質(zhì)粒；
[0040] 2)Bar基因表達(dá)盒的制備：采用核酸內(nèi)切酶Hind III和Xho I酶切步驟1)獲得的 含有bar基因的質(zhì)粒，得酶切產(chǎn)物；將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳純化，收集含有啟動(dòng)子、bar基因目 的片段和終止子的Bar基因表達(dá)盒；
[0041] 該Bar基因的表達(dá)盒可用于制備DNA微彈，再利用基因槍對(duì)甘蔗進(jìn)行轉(zhuǎn)化；
[0042] 3)基因槍轉(zhuǎn)化：將步驟2)獲得的Bar基因表達(dá)盒制備DNA微彈，用裝載有DNA微 彈的基因槍轟擊甘蔗愈傷組織，對(duì)轟擊后的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)；
[0043] 4)抗性篩選：使用除草劑進(jìn)行抗性篩選，再生培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因植株。
[0044] 以下實(shí)施例中，所采用的甘蔗基因型為甘蔗品種新臺(tái)糖20號(hào)、新臺(tái)糖22號(hào)、粵糖 00-236。本發(fā)明中bar基因?yàn)槌輨┗颉?br>[0045] 以下實(shí)施例中，所述Sorbitol為山梨（糖）醇，所述Mannitol為甘露醇。
[0046] 實(shí)施例1 :
[0047] -種甘蔗無(wú)載體框架轉(zhuǎn)基因方法，包括以下步驟：
[0048] 1)質(zhì)粒的提取
[0049] 平板挑取含有Bar的大腸桿菌的單菌落，接種于含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中， 37 °C搖床過(guò)夜，收集菌體，獲得含有bar基因的質(zhì)粒；
[0050] 具體質(zhì)粒提取方法可參見(jiàn)《植物基因工程原理與技術(shù)》，王關(guān)林、方宏筠等編。
[0051] 2) Bar基因表達(dá)盒的制備
[0052] a)取步驟1)獲得的含有bar基因的質(zhì)粒10 y g，加入10*buffer 10 y L、HindIII 酶2 y L和Xho I酶2 y L，加入雙蒸水定容至100 y L，37°C過(guò)夜，得酶切產(chǎn)物；
[0053] b)取酶切產(chǎn)物，在10XTAE電泳緩沖液中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)迀移至 5cm-8cm時(shí)，切下bar基因目的片段的膠塊，收集含有啟動(dòng)子、bar基因目的片段和終止子的 Bar基因表達(dá)盒，調(diào)整bar基因目的片段的濃度為100ng/yL，-20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?；圖1為Bar 基因表達(dá)盒示意圖；圖2為酶切產(chǎn)物電泳圖。
[0054] 3)基因槍轉(zhuǎn)化
[0055] i) DNA微彈的制備：