用于肝癌預(yù)后評(píng)估的微小核酸序列、探針以及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及肝癌檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，涉及用于肝癌預(yù)后評(píng)估的微小核酸序列、探 針以及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性肝癌是世界第五大常見惡性腫瘤，超過90%的原發(fā)性肝癌是肝細(xì)胞性肝癌 (HepatocellularCarcinomas,HCCs，簡(jiǎn)稱肝癌）。我國是肝癌高發(fā)地區(qū)，其死亡率在惡性腫 瘤中上升至第二位。但是，HCC患者就診時(shí)往往已是晚期，出現(xiàn)包括遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或肝內(nèi)轉(zhuǎn)移等 并發(fā)癥，手術(shù)的根治性切除率很低，預(yù)后通常很差，而轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)也一直是影響肝癌治療效果 的重要因素。肝癌的轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及許多調(diào)控因素的復(fù)雜過程。目前已知有肝癌及間質(zhì)細(xì) 胞遺傳學(xué)與表面遺傳學(xué)的改變引起的基因、細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)和粘附能力、局部血管生成能力、 細(xì)胞代謝功能以及癌細(xì)胞與宿主、癌細(xì)胞與細(xì)胞間質(zhì)之間相互作用等過程的改變參與肝癌 的轉(zhuǎn)移。
[0003] 腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中癌細(xì)胞和癌旁基質(zhì)之間的相互調(diào)節(jié)作為一個(gè)動(dòng)態(tài)系統(tǒng)已 被廣泛研究。由于肝細(xì)胞癌引起死亡的主要原因是腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，因此深入研究腫瘤 轉(zhuǎn)移過程中重要的節(jié)點(diǎn)分子將有助于系統(tǒng)性闡述肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理。微小核酸分子的發(fā) 現(xiàn)描述了一種全新的基因活動(dòng)形式，即轉(zhuǎn)錄后翻譯水平的修飾。大量互相影響并且在幕后 控制分子的微小核酸分子參與了這種活動(dòng)。近年來，有大量關(guān)于促轉(zhuǎn)移和抑制轉(zhuǎn)移基因、微 小核酸分子和細(xì)胞代謝在肝癌轉(zhuǎn)移中作用機(jī)制的研究，在一定程度上揭示了肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù) 發(fā)的調(diào)控機(jī)制。但是對(duì)于肝細(xì)胞癌的基礎(chǔ)研究和臨床治療而言，一個(gè)必須重視的命題是對(duì) 肝細(xì)胞癌的預(yù)后影響因素進(jìn)行深入研究。
[0004] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種用于肝癌預(yù)后評(píng)估的微小核酸序列，所述的微小 核酸序列在肝癌中高表達(dá)，除了可影響肝癌干細(xì)胞的生長，化療抵抗及自我更新能力之外， 還可以通過靶向抑制其他分子調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力。通過對(duì)這些肝癌特異性的微 小核酸進(jìn)行檢測(cè)，可預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌手術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等事件，并判斷預(yù)后，對(duì)于肝細(xì)胞癌病 人術(shù)后監(jiān)控和序貫治療具有非常重要的指導(dǎo)意義。
[0006] 本發(fā)明的第二目的在于提供一種探針，該探針根據(jù)SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12 所示核酸序列制得，利用該探針通過原位雜交的方法檢測(cè)微小核酸序列，靈敏度高，特異性 強(qiáng)。
[0007] 本發(fā)明的第三目的在于提供一種試劑盒，該試劑盒含有上述探針，該試劑盒針對(duì) 這些肝癌特異性的微小核酸進(jìn)行檢測(cè)，可預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌手術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等事件，并判斷預(yù) 后，對(duì)于肝細(xì)胞癌病人術(shù)后監(jiān)控和治療具有非常重要的指導(dǎo)意義。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
[0009] 一種用于肝癌預(yù)后評(píng)估的微小核酸序列，包括SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12核酸序 列中的任一種或多種。
[0010]SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12 核酸序列具體如下：
[0011]SEQNo. 1 ：5, -UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3,
[0012] SEQNo. 2 :5' -TAATACTGTCTGGTAAAACCGT-3'
[0013]SEQNo. 3 :5' -ACGGUUUUACCAGACAGUAUUA-3'
[0014]SEQNo. 4 :5' -ACGGTTTTACCAGACAGTATTA-3'
[0015]SEQNo. 5 :5' -UGAGGUUGGUGUACUGUGUGUGA-3，
[0016]SEQNo. 6 :5' -TGAGGTTGGTGTACTGTGTGTGA-3'
[0017] SEQNo. 7 :5, -UCACACACAGUACACCAACCUCA-3'
[0018]SEQNo. 8 :5, -TCACACACAGTACACCAACCTCA-3'
[0019]SEQNo. 9 :5' -CUGCGCAAGCUACUGCCUUGCU-3'
[0020] SEQNo. 10 :5' -CTGCGCAAGCTACTGCCTTGCT-3'
[0021] SEQNo. 11 :5' -AGCAAGGCAGUAGCUUGCGCAG-3'
[0022] SEQNo. 12 :5, -AGCAAGGCAGTAGCTTGCGCAG-3,。
[0023] 本發(fā)明通過收集臨床肝癌病人門靜脈癌栓/肝癌原發(fā)灶/癌旁正常肝組織新鮮冰 凍配對(duì)樣本，利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)門靜脈癌栓/肝癌原發(fā)灶/癌旁正常肝組織樣本中特異 微小核酸分子的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證，再利用鎖核酸（LNA)探針-原位雜交技術(shù)，檢測(cè)特異微 小核酸分子在門靜脈癌栓/肝癌原發(fā)灶/癌旁正常肝組織樣本的表達(dá)豐度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)特 異微小核酸分子在門靜脈癌栓中高表達(dá)，且在肝癌原發(fā)灶及癌旁正常組織中的表達(dá)逐漸降 低，并可以通過靶向抑制其他分子調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力，表明特異微小核酸分子 表達(dá)水平可作為肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)。
[0024] 經(jīng)驗(yàn)證，對(duì)SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 4核酸序列中的任一種進(jìn)行檢測(cè)，可用于肝癌 預(yù)后評(píng)估，特異性好，反應(yīng)靈敏，可靠性更高。優(yōu)選地，包括SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 4核酸 序列中的任一種。
[0025] 更優(yōu)選地，包括SEQIDNo.1核酸序列。
[0026] 本發(fā)明還提供了根據(jù)上述微小核酸序列制備的探針。
[0027] 該探針根據(jù)SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12所示核酸序列制得，利用該探針通過原位 雜交的方法檢測(cè)微小核酸序列，靈敏度高，特異性強(qiáng)。
[0028] 優(yōu)選地，所述探針與SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12所示核酸序列和/或其互補(bǔ)序列 的全部或連續(xù)15個(gè)以上核苷酸片段互補(bǔ)。即可達(dá)到檢測(cè)的特異性和靈敏度的要求。
[0029] 微小核酸分子的特異性探針，為可任意能夠特異性與特異微小核酸分子結(jié)合的脫 氧/核糖核酸探針，或經(jīng)過修飾、標(biāo)記的核酸片段。進(jìn)一步地，所述探針為脫氧核糖核酸探 針或核糖核酸探針。
[0030] 進(jìn)一步地，所述探針包括鎖核酸探針、熒光探針、地高辛標(biāo)記探針、生物素標(biāo)記探 針中的任一種。以這些標(biāo)記物制備的探針，得到的檢測(cè)信號(hào)便于區(qū)分。
[0031] 本發(fā)明還提供了一種用于肝癌預(yù)后評(píng)估的試劑盒，包括上述的探針。
[0032] 該試劑盒含有根據(jù)SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12所示核酸序列制備的探針，將特 異微小核酸分子作為分子標(biāo)記，利用特異微小核酸分子的特異性探針，結(jié)合原位雜交探針 試劑，檢測(cè)特異微小核酸分子在肝癌組織中的表達(dá)量，預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌手術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等事 件，并判斷預(yù)后，對(duì)于肝細(xì)胞癌病人術(shù)后監(jiān)控和治療具有非常重要的指導(dǎo)意義。
[0033] 為了便于檢測(cè)，優(yōu)選地，所述試劑盒還包括原位雜交試劑。
[0034] 根據(jù)原位雜交的需要，可選擇原位雜交試劑。進(jìn)一步地，所述原位雜交試劑包括但 并不限于以下這些試劑：二甲苯、乙醇、DEPC水、PBS、蛋白酶K、甘氨酸、PBS、多聚甲醛、雜交 液、清洗液、封閉液、平衡液、顯色劑。
[0035] 采用微小核酸序列能夠進(jìn)行肝癌預(yù)后評(píng)估，步驟如下：
[0036] 制備待檢測(cè)樣本的組織芯片；
[0037] 將所述組織芯片進(jìn)行原位雜交，所述原位雜交采用的探針為本發(fā)明提供的根據(jù) SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12所示核酸序列制備；
[0038] 根據(jù)原位雜交后的組織芯片的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行判斷。
[0039] 為了使檢測(cè)的樣本可靠性更高，進(jìn)一步地，所述組織芯片由組織芯片制作儀制備， 所述組織芯片的厚度為3-5ym。
[0040] 利用組織芯片制作儀依次從供體蠟塊上穿取直徑為1mm的組織芯，插入有240個(gè) 點(diǎn)陣的受體蠟塊中，以3-5ym的厚度連續(xù)切片即得。
[0041] 通過對(duì)供體組織的多個(gè)位點(diǎn)測(cè)定，以增加準(zhǔn)確性。
[0042] 進(jìn)一步地，所述組織芯片的信號(hào)強(qiáng)度通過生物圖像處理軟件分析得到。通過生物 圖像處理軟件對(duì)得到的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行分析，方便快捷，并減少人為操作的誤差。
[0043] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0044] (1)本發(fā)明提供了一種用于肝癌預(yù)后評(píng)估的微小核酸序列，所述的微小核酸序列 在肝癌中高表達(dá)，除了可影響肝癌干細(xì)胞的生長，化療抵抗及自我更新能力之外，還可以通 過靶向抑制其他分子調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力。通過對(duì)這些肝癌特異性的微小核酸進(jìn) 行檢測(cè)，可預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌手術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等事件，并判斷預(yù)后，對(duì)于肝細(xì)胞癌病人術(shù)后監(jiān) 控和序貫治療具有非常重要的指導(dǎo)意義。
[0045] (2)本發(fā)明還提供了一種探針，該探針根據(jù)SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12所示核酸 序列制得，利用該探針通過原位雜交的方法檢測(cè)微小核酸序列，靈敏度高，特異性強(qiáng)。
[0046] (3)本發(fā)明還提供了一種試劑盒，該試劑盒含有根據(jù)SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 12 所示核酸序列制備的探針，通過探針對(duì)這些肝癌特異性的微小核酸進(jìn)行檢測(cè)，可預(yù)測(cè)肝細(xì) 胞癌手術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等事件，并判斷預(yù)后，對(duì)于肝細(xì)胞癌病人術(shù)后監(jiān)控和治療具有非常重 要的指導(dǎo)意義。
【附圖說明】
[0047] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0048]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中不同肝組織樣本中的特異微小核酸分子表達(dá)水平圖；
[0049]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中基于肝癌病人組織芯片的鎖核酸原位雜交實(shí)驗(yàn)制備的石 蠟切片樣本中特異微小核酸分子染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)示意圖；
[0050] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中對(duì)207例肝癌病人的組織芯片進(jìn)行預(yù)后評(píng)估的生存期曲 線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0051] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市售獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0052] 實(shí)施例1
[0053] 特異微小核酸分子在肝癌門靜脈癌栓中的表達(dá)
[0054] 1.臨床組織樣本的選?。?br>[0055] 臨床組織樣本來源于上海某醫(yī)院，以上樣本均獲得本人的知情同意，獲取18例肝 癌組織樣本及其配對(duì)門靜脈癌栓，癌旁正常肝組織。
[0056] 2.特異微小核酸分子在肝癌門靜脈癌栓中表達(dá)異常：
[0057] 對(duì)18例HCC病人的門靜脈癌栓（PVTT)/原發(fā)灶/癌旁正常肝組織樣本中的特異 微小核酸分子（SEQIDNo. 1-SEQIDNo.4)表達(dá)水平進(jìn)行的定量PCR檢測(cè)。
[0058] 具體為：將各個(gè)待檢測(cè)樣本分別提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用探針進(jìn)行定量 PCR檢測(cè)。
[0059] 其中，定量PCR檢測(cè)所使用的反轉(zhuǎn)