一種中華鱉膠原蛋白肽的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種中華鱉膠原蛋白肽的制備方法及其應(yīng)用，屬于天然活性物質(zhì)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 海洋來源的多糖、蛋白聚糖和膠原蛋白肽是十分重要的天然海洋食品資源，常常 具有顯著的生活活性，如海參多糖、海藻多糖等均有許多的研究報(bào)道，證實(shí)其具有顯著的生 物活性。
[0003]中華鱉（Pelodiscus sinensis)，又稱甲魚，具有重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值，是我國 傳統(tǒng)的滋補(bǔ)佳品。《本草綱目》、《中國中醫(yī)藥藥典》等歷史著作中論其功能有治療疾病和養(yǎng) 生益壽的雙重功效，中華鱉還含有較多的氨基酸、多肽和多糖，對人體的生理活性同樣具有 很重要的功能。然而，以中華鱉為原料，從中分離提取制備膠原蛋白肽的研究報(bào)道國內(nèi)外尚 很少見，迄今未見有從中分離提取具有免疫增強(qiáng)活性的膠原蛋白肽的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)提供一種體外抗氧化能力 強(qiáng)和免疫活性強(qiáng)的中華鱉膠原蛋白肽的制備方法。
[0005] 本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)提供一種通過上述制備 方法所得的中華鱉膠原蛋白肽的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：該中華鱉膠原蛋白肽的制備方 法，其特征在于：包括如下步驟：
[0007] (1)預(yù)處理：將中華鱉的裙邊洗凈剪碎，經(jīng)磷酸緩沖液處理除去雜蛋白及雜質(zhì)，便 于酶解；
[0008] (2)酶解：將步驟⑴所得的膠原蛋白溶液，向其中加入木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，將 膠原蛋白轉(zhuǎn)化成膠原蛋白肽；
[0009] (3)滅酶：對步驟⑵所得到的酶解液進(jìn)行滅酶，冷卻；
[0010] (4)離心：將步驟⑶的酶解液離心，取上清液；
[0011] (5)膜分離：通過膜分離截留上清液中分子量小于lOOOODa的膠原蛋白肽組分；
[0012] (6)濃縮：將膜分離所得的膠原蛋白肽組分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，便于凍干；
[0013] (7)凍干：將濃縮后上清液冷凍干燥成粉末，即為成品，于干燥條件下貯存起來。
[0014] 進(jìn)一步地，所述步驟（1)中磷酸緩沖液的濃度為1. 25%，該磷酸緩沖液的添加量 為中華鱉的裙邊質(zhì)量的10~15倍。
[0015] 在酶解的過程中對于的酶解條件得進(jìn)行綜合控制，才能保證膠原蛋白多肽的高提 取率。作為優(yōu)選，所述步驟（2)中所述木瓜蛋白酶的加酶量為3000~4000U/g、酶解溫度為 45~55°C、酶解時間為2~4h、pH值為7. 0~8. 5,所得膠原蛋白肽提取率為40~48. 6%。
[0016] 進(jìn)一步地，所述步驟（3)中的滅酶步驟為：對步驟（2)所得到的酶解液放入50~ 55°C的沸水浴中加熱滅酶，滅酶時間為10~15min。
[0017] 進(jìn)一步地，所述步驟（4)中酶解液在4000~10000r/min離心15~20min得上清 液。
[0018] 進(jìn)一步地，所述步驟（5)中的具體操作為：依次采用0.22 ym膜中進(jìn)行過濾，再選 用分子量l〇〇〇〇Da的超濾膜截留離心后的上清液，分離得到小于lOOOODa的膠原蛋白肽組 分。
[0019] 運(yùn)用兩次膜分離濃縮膠原蛋白肽，以提高膠原蛋白肽產(chǎn)品的肽含量和純度，去除 糖類、大分子蛋白等雜質(zhì)，產(chǎn)品的肽含量可達(dá)24. 28 %。
[0020] 進(jìn)一步地，所述步驟（7)中分離得到的膠原蛋白肽組分于50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20~ 30min，并于-80至-20°C冷凍干燥40~48h即得中華鱉膠原蛋白肽產(chǎn)品。
[0021] 本發(fā)明還提供一種中華鱉膠原蛋白肽的制備方法在具有免疫增強(qiáng)功能的藥品、保 健品、護(hù)膚美容用品的制備中的應(yīng)用。
[0022] 為此本發(fā)明通過以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明中華鱉膠原蛋白肽的體外抗氧化性及免疫 增強(qiáng)功能。
[0023] 1.體外抗氧化性研究
[0024]通過鐵離子還原體系和具有代表性的02- ?、DPPH ?、? 0H三種自由基體系的實(shí) 驗(yàn)，研究膠原蛋白肽體外對自由基的清除效果。以膠原蛋白肽的活性氧和自由基清除能力 作為抗氧化性的指標(biāo)進(jìn)行測定。以清除活性氧（02- ?、? 0H、H202)及有機(jī)自由基? DPPH能 力作為評價(jià)指標(biāo)。
[0025] 2?體內(nèi)免疫活性研究
[0026] 通過小鼠的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)研究中華鱉膠原蛋白肽的免疫活性，主要從免疫器官指數(shù)的 測定、肝臟抗氧化指標(biāo)的測定和Cyplal、HSP70的mRNA表達(dá)的測定三個方面進(jìn)行研究。
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用一次性酶法結(jié)合膜分離技術(shù)提取中華鱉 裙邊膠原蛋白肽，用時僅為2~4h，相對一般研究的5_6h，有效降低了酶解時間，另外，膠原 蛋白多肽的分子量決定了其生物活性，分子量較大的多肽片段生物活性較低，運(yùn)用兩次膜 分離濃縮膠原蛋白肽，以分離得到小于l〇〇〇〇Da的膠原蛋白肽，能顯著地提高膠原蛋白肽 產(chǎn)品的肽含量和純度，同時還解決膠原蛋白肽的低生物活性問題；最后將分離出來的膠原 蛋白肽對小鼠去毒相關(guān)基因的mRNA表達(dá)研究及體外抗氧化性的研究表明，與正常組相比， 膠原肽對小鼠脾臟Cyplal、HSP70基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用，且在經(jīng)膜分離前和經(jīng)膜分離 后膠原蛋白肽的清除率比較中，經(jīng)兩次膜分離后的膠原蛋白肽，其清除羥基自由基的能力 最強(qiáng)，并且具有一定的劑量效應(yīng)，因此推測膠原蛋白肽具有較強(qiáng)的體外抗氧化性，同時也能 有效地調(diào)節(jié)小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，說明鱉源膠原蛋白肽可用于開發(fā)具有免疫增 強(qiáng)功能的藥品、保健品、護(hù)膚美容用品等。
【附圖說明】
[0028] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中的中華鱉膠原蛋白肽清除羥基自由基的能力的示意圖 (其中，+為VC，為超濾后樣品，為超濾前樣品）；
[0029] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中的中華鱉膠原蛋白肽與Vc抗氧化的能力比較示意圖（其 中，?為vc，《?為超濾后樣品，-*為超濾前樣品）；
[0030] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中的中華鱉膠原蛋白肽過濾前和過濾后抗氧化的能力比較 不意圖（其中，為超濾后樣品為超濾如樣品）；
[0031] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中的中華鱉膠原蛋白肽清除有機(jī)自由基*DPPH的能力的示 意圖（其中，?^為VC，為超濾后樣品，?^為超濾前樣品）；
[0032] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例7中的體內(nèi)去毒相關(guān)基因的mRNA表達(dá)的電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 以下通過結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0034] 實(shí)施例1中華鱉膠原蛋白肽的制備
[0035] -種中華鱉膠原蛋白肽的制備方法，包括如下步驟：
[0036] (1)預(yù)處理：將中華鱉的裙邊洗凈剪碎，經(jīng)濃度為1. 25%的磷酸緩沖液處理除去 雜蛋白及雜質(zhì)，便于酶解，其中磷酸緩沖液的添加量為中華鱉的裙邊質(zhì)量的10倍；
[0037] (2)酶解：將步驟⑴所得的膠原蛋白溶液，向其中加入4000U/g的木瓜蛋白酶， 在溫度55°C和pH值7. 0的條件下酶解4h，膠原蛋白肽的提取率為48% ;
[0038] (3)滅酶：在55°C的沸水浴中加熱lOmin滅酶；
[0039] (4)離心：在4000r/min離心15~20min得上清液。取上清液；
[0040] (5)膜分離：依次采用0? 22um膜中進(jìn)行過濾，再選用分子量lOOOODa的超濾膜截 留離心后的上清液，分離得到小于l〇〇〇〇Da的膠原蛋白肽組分；
[0041] (6)濃縮：將膜分離所得的膠原蛋白肽組分于50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20min濃縮；
[0042] (7)凍干：將濃縮后上清液于-20°C冷凍干燥40h即得鱉源膠原蛋白肽產(chǎn)品。
[0043] 實(shí)施例2中華鱉膠原蛋白肽清除羥基自由基的能力
[0044] 羥基自由基清除能力測定方法為：在反應(yīng)體系中加入2. 5mL，9mmol/L FeS04溶液 和2. 5mL，9mmol/L水楊酸一乙醇溶液，再加入2、4、6、8、10mg/mL不同濃度的超濾前的膠原 蛋白肽和超濾后的膠原蛋白肽2. 5mL，超濾前的膠原蛋白肽和超濾后的膠原蛋白肽均溶于