結(jié)核桿菌感染檢測的熒光原位雜交檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于結(jié)核桿菌感染檢測的熒光原位雜交 檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病被列為我國重大傳染病之一，是嚴重危害人民群眾健康的呼吸道傳染病。 衛(wèi)生部全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，目前我國結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為 130萬，占全球發(fā)病的14. 3%，位居全球第2位。2001~2010年，全國共發(fā)現(xiàn)和治療肺結(jié)核 患者828萬例，其中傳染性肺結(jié)核患者450萬例。
[0003] 傳統(tǒng)上診斷肺結(jié)核，有三種途徑：（1)痰液及病變組織中查出結(jié)核桿菌；（2)結(jié)核 的病理組織常規(guī)檢查；（3)胸部X線檢查，但該方法不能確診肺結(jié)核，因為肺部其他疾病，如 肺炎、肺寄生蟲病、肺部腫瘤等病變也可出現(xiàn)類似肺結(jié)核病變的肺部X線影像學表現(xiàn)，單憑 X線檢查，許多病人會誤診誤治，不但給病人造成經(jīng)濟上的損失，還會導致病情惡化。痰液及 病變組織結(jié)核桿菌陽性一般來說是肺結(jié)核最可靠的診斷，稱為金標準。但是由于檢出率低， 如果單獨以痰液結(jié)核桿菌檢查作為唯一的診斷標準會造成大部分結(jié)核患者的漏診。
[0004] 病理學診斷在疾病診斷中的價值逐漸體現(xiàn)出來，變得越來越重要。目前結(jié)核病的 病理診斷主要靠組織學的特殊形態(tài)改變和抗酸染色。組織學存在病變形態(tài)不典型、與結(jié)節(jié) 病、肺癌、肺炎等病理組織學形態(tài)相似的情況，而且某些細菌的感染也會引起類似結(jié)核病的 組織形態(tài)，因此容易誤診。抗酸染色由于針對的是所有抗酸桿菌，特異性不強，染色陽性者 還須與其它非致病的抗酸桿菌進行鑒別，而且受實驗條件的影響很大，如脫蠟不凈、酒精、 初染溫度、背景等，很容易出現(xiàn)結(jié)果的假陰性，造成誤診。長期以來由于診斷技術(shù)的不足，全 國約有50%的肺結(jié)核病人未能及時確診及時治療，給健康人群構(gòu)成巨大威脅。因此，建立一 種可以輔助病理醫(yī)生從疑似肺結(jié)核患者的肺活檢組織中快速、明確診斷出是否存在結(jié)核桿 菌感染的方法就顯得尤為必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高靈敏度、高可信度同時又非 常直觀的結(jié)核桿菌感染檢測試劑盒及其檢測方法。
[0006] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的： 一種用于結(jié)核桿菌熒光原位雜交檢測的分子探針；分別為IS6110探針，其序列如SEQ ID N0:1所示；MPRT40探針，其序列如SEQ ID N0:2所示；和16s rRNA其序列如SEQ ID N0: 3所示。
[0007] 用于結(jié)核桿菌感染檢測的熒光原位雜交檢測試劑盒，其組成包括：雜交液、DAPI 復染劑，和分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。
[0008] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述雜交液含有焚光標記的三種特異探針，分別為 IS6110探針，其序列如SEQ ID N0:1所示；MPRT40探針，其序列如SEQ ID N0:2所示；和 16s rRNA探針，其序列如SEQ ID NO :3所示；三種探針的濃度分別為10-50pM ;進一步優(yōu)選 為 30pM。
[0009] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述雜交液的具體組成為：10%(w/v)硫酸葡聚糖， 10mMNaCl，20% (v/v)甲酰胺，0. 1% (w/v)焦磷酸鈉，0. 2% (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，5mM Na2EDTA，0.1% (v/v)TritonX-100,50mM Tris/HCl(pH7.5);分別為30pM的所述熒光標記的 二種特異探針。
[0010] 所述DAPI復染劑的主要成分為DAPI (4, 6-二脒基-2-苯吲哚鹽酸)和抗褪色液。
[0011] 每次檢測都必須同時進行質(zhì)控片操作，質(zhì)控片必須和病例樣本一同操作。質(zhì)控片 可以購買商品化對照片或者選擇已知的對照樣本自行制備。
[0012] 本發(fā)明的試劑盒能夠用于檢測的樣本范圍廣泛，包括但不限于，痰、咽拭子、胃灌 洗液、支氣管灌洗液、活體組織、吸引物、咳出物、體液（脊髓、胸腹水、心包液等）、血液、膿 液、骨髓、尿液、組織切片、食物樣本、來自土壤、空氣和水的樣本，以及它們的培養(yǎng)物。這些 樣本經(jīng)相應(yīng)處理后，原則上是只要保持細胞形態(tài)完整并且靶核酸未被破壞，均可使用本發(fā) 明的試劑盒進行檢測。這些樣本的處理方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的，例如： 痰：痰液涂片法； 膿液：同痰液涂片法； 病灶組織：對病灶組織進行切片； 尿液：留全量夜尿，靜置4~5h后，棄上清液，取沉淀部分尿液10ml，3000rpm，離 心30min，取沉淀物涂片； 胸、腹水標本：參照尿液涂片法； 腦脊液：無菌操作收集腦脊液，放置冰箱或室溫24h，待薄膜形成后涂片。也可將腦脊 液離心沉淀，3000rpm，離心30min，棄上清液，取沉淀物涂片。
[0013] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點： (1) 能直觀的將檢測結(jié)核桿菌與其引起的病理變化結(jié)合起來； (2) 在高效、準確檢測結(jié)核桿菌的同時可由樣本病理切片上分析感染率和感染強度，這 是其他分子生物學檢測方法所不具有的特點； (3) 由于雜交過程中探針與IS6110、MPRT40和16s rRNA的雜交是特異的，且信號是用 熒光標記的，所以較常規(guī)的染色觀察檢測靈敏、準確； (4) 本發(fā)明雜交顯色后的病理切片可長期保存。
[0014]
【附圖說明】
[0015] 圖1.結(jié)核桿菌感染的肺結(jié)核病理組織切片雜交檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0016] 下面將結(jié)合附圖以及進一步的詳細說明來舉例說明本發(fā)明。需要指出的是，以下 說明僅僅是對本發(fā)明要求保護的技術(shù)方案的舉例說明，并非對這些技術(shù)方案的任何限制。 本發(fā)明的保護范圍以所附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準。
[0017] 實施例1特異性探針的制備 根據(jù)NCBI報道的人源結(jié)核桿菌基因序列，進行同源性比對分析，查找該基因的最保守 區(qū)域，選取IS6110、MPRT40和16s rRNA基因作為靶序列，結(jié)合運用primer5. 0、oligo6. 0和 Primer express2. 0軟件，設(shè)計出三組結(jié)合桿菌特異性熒光探針。將探針放入NCBI作BLAST 進行同源性分析，結(jié)果顯示與其他基因序列異源，從而避免了雜交時非特異性的存在。探針 由生工生物工程(上海）有限公司合成。
[0018] 所述的三條寡核苷酸探針的序列分別如SEQIDN0 :1-3所示。
[0019] 熒光標記探針的制備：選用FITC熒光素，采用缺口平移法進行探針的直接標記。 將熒光素直接與探針核苷酸以磷酸戊糖骨架共價結(jié)合。具體步驟如下： ①使用TE緩沖液將PCR純化產(chǎn)物溶解成終濃度為lg/L。
[0020] ②制備含1 y 1濃度是3 mg/ml的DNA酶儲存液及10 XDNA酶溶液，體積為1ml。
[0021] ③冰浴中配制缺口平移反應(yīng)體系，加樣完成后混勻，37°C靜置12 min。具體反應(yīng) 體系如下：
④加入2. 5 y 1濃度為10U/ y 1的大腸桿菌DNA聚合酶。
[0022] ⑤置PCR擴增儀，15°C孵育12個小時，70°C變性5