miR-21反義核苷酸修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及成體干細(xì)胞領(lǐng)域，通過(guò)特異性反義核苷酸序列沉默間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymalstemcell，MSCs)中內(nèi)源性miR-21的表達(dá)水平增強(qiáng)了MSCs的免疫調(diào)節(jié)能 力，并研究修飾后的MSCs用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 傳統(tǒng)概念中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等MSCs首次分離后被證明在不同的誘導(dǎo)環(huán)境下可 以分化為骨、軟骨、脂肪、胰島、肝臟和神經(jīng)等不同組織細(xì)胞，是目前治療骨骼疾病最常用的 種子細(xì)胞，但隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其移植回體內(nèi)后成骨能力明顯下降，而且其多向分 化能力也逐漸丟失。此外研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠通過(guò)抑制多種免疫細(xì)胞如樹突狀 細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞的功能，發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。臨床上MSCs被運(yùn)用到全 身，治療各種系統(tǒng)性疾病，如糖尿病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，干燥綜合征等，在機(jī)體免疫調(diào)控中發(fā) 揮著重要作用。但是尚需要開發(fā)輸注細(xì)胞的新途徑，目前通過(guò)靜脈輸注細(xì)胞的方法。其所 面臨的問(wèn)題就是植入效率不均一，對(duì)有些病例不能產(chǎn)生明顯和持久的治療作用。此外，隨著 體外培養(yǎng)的時(shí)間延長(zhǎng)，MSCs也會(huì)喪失部分的生物學(xué)活性，降低應(yīng)用效率。越來(lái)越多的課題 組都開始意識(shí)到重新尋找構(gòu)建一種提高M(jìn)SCs的植入效率的重要性，使其產(chǎn)生更加明顯和 持久的治療作用。
[0003] 微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的小分子、非編 碼的單鏈RNA，長(zhǎng)度19~25nt，與細(xì)胞的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)歸有密切關(guān)系，能調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等。 miRNAs介導(dǎo)特異性的基因沉默或激活靶mRNA而影響蛋白質(zhì)合成，調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平的基因 表達(dá)，現(xiàn)已證明miRNAs能夠調(diào)控多種生理學(xué)和病理學(xué)過(guò)程[8-10]。miRNAs具有高度的生物 進(jìn)化保守性、組織特異性、基因簇集現(xiàn)象、時(shí)空特異性等生物學(xué)特性[11]。miRNAs通過(guò)RNA 干擾途徑降解靶mRNA;動(dòng)物中miRNAs與靶mRNA的3'-不翻譯區(qū)部分序列反向互補(bǔ)結(jié)合， 與RNA干擾不同的是，革ElmRNA的穩(wěn)定性不受影響，而翻譯起始后受抑制。因此，通過(guò)miRNAs 的特異性互補(bǔ)反義鏈可以改變細(xì)胞中miRNA的表達(dá)水平，增加靶基因的轉(zhuǎn)錄后水平從而改 變細(xì)胞的增殖，分化能力。
[0004]目前可通過(guò)在細(xì)胞中使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式特異沉默細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性miRNA的表 達(dá)水平。此種改變miRNA表達(dá)的基因修飾方式與傳統(tǒng)的基因修飾相比有：不需要病毒載體， 解決了病毒在體內(nèi)的不可控性的問(wèn)題；轉(zhuǎn)染效率高；易操作等特點(diǎn)。通過(guò)在細(xì)胞中使用脂 質(zhì)體轉(zhuǎn)染miRNA的特異反義鏈可高效地沉默細(xì)胞內(nèi)miRNA的內(nèi)源性表達(dá)。在本課題組的研 究中發(fā)現(xiàn)，miR-21的表達(dá)水平負(fù)向調(diào)控MSCs中轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子-0I(transforminggrowth factor-0 1，TGF-0 1)的表達(dá)水平。TGF-0 1作為一種免疫抑制劑可以抑制免疫活性細(xì) 胞的增殖和抑制淋巴細(xì)胞增殖，從而影響MSCs的免疫調(diào)節(jié)能力。因此本
【發(fā)明內(nèi)容】
為利用 miR-21反義鏈轉(zhuǎn)染MSCs增強(qiáng)細(xì)胞分泌TGF-1的能力，進(jìn)而持續(xù)增強(qiáng)MSCs的免疫調(diào)節(jié)能 力。之后再將miRNA反義鏈修飾過(guò)的MSCs應(yīng)用到干細(xì)胞治療效果不明顯或者無(wú)效的系統(tǒng) 性疾病中，提高干細(xì)胞在有效時(shí)間內(nèi)對(duì)于系統(tǒng)性疾病的治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的
[0006] 1)提出一種簡(jiǎn)便、成本低廉、不需要病毒載體且對(duì)人體無(wú)毒副作用的干細(xì)胞修飾 方法；
[0007] 2)提出經(jīng)上述修飾后的干細(xì)胞的制備方法；
[0008] 3)提出經(jīng)上述修飾增強(qiáng)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力特性的優(yōu)化方法；
[0009] 4)提出經(jīng)修飾后的干細(xì)胞可能治療的臨床疾病。
[0010] 發(fā)明思路
[0011]anti-sense-miRNA作為相應(yīng)miRNA的完全互補(bǔ)鏈，均是經(jīng)2' 甲基穩(wěn)定性化 學(xué)修飾的小RNA分子?？梢酝ㄟ^(guò)與對(duì)應(yīng)miRNA特異性相互作用，促進(jìn)該miRNA的降解，從而 實(shí)現(xiàn)對(duì)特定miRNA功能的抑制，阻斷miRNA在細(xì)胞中的作用。通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)miR-21能 夠負(fù)向調(diào)節(jié)MSCs的免疫調(diào)節(jié)能力。因此本專利內(nèi)容欲通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式將miR-21的 反義鏈miR-21inhibitor轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，特異性沉默細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平，阻斷細(xì)胞 內(nèi)miR-21下游通路來(lái)提高M(jìn)SCs的免疫調(diào)節(jié)能力。因此如何將這種核苷酸序列導(dǎo)入細(xì)胞的 方式將是一個(gè)重要的考慮內(nèi)容。另外導(dǎo)入miR-21inhibitor的濃度也是需要謹(jǐn)慎選擇的， 最佳的濃度下才可以起到最佳的效果，最后找到修飾后干細(xì)胞的制備方法及應(yīng)用的適應(yīng)癥 都是本發(fā)明專利的內(nèi)容。
[0012] 本發(fā)明的有益效果
[0013] 1.本發(fā)明所制備的干細(xì)胞方法簡(jiǎn)便、快捷、產(chǎn)品無(wú)害。
[0014] 鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明制備的MSCs維持了基本的細(xì)胞形態(tài)，保持了細(xì)胞間連接， 并且保存了細(xì)胞外基質(zhì)連接形成的支架，未破壞細(xì)胞表面蛋白的粘附增殖及分化等功能轉(zhuǎn) 染miR-21inhibitor對(duì)干細(xì)胞的增殖和凋亡沒有影響，說(shuō)明轉(zhuǎn)染miR-21inhibitor對(duì)MSCs 沒有細(xì)胞毒性。
[0015] 2.本發(fā)明所制備的干細(xì)胞產(chǎn)品生物學(xué)性能穩(wěn)定，通過(guò)在體外對(duì)其性能的優(yōu)化并篩 選，明確所制備的產(chǎn)品具有更顯著的免疫能力
[0016] 從基因水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染后一周時(shí)間內(nèi)人MSCs、小鼠BMMSCs均可穩(wěn)定地維持 沉默miR-21的表達(dá)效應(yīng)，而且可持續(xù)大幅度提高細(xì)胞對(duì)TGF-P1的分泌水平；同時(shí)通過(guò)與 T細(xì)胞共培養(yǎng)可促進(jìn)T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatoryTcells，Tregcells)分化比例。 即本發(fā)明所制備的干細(xì)胞產(chǎn)品增強(qiáng)了干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力。
[0017] 3.本發(fā)明所涉及的干細(xì)胞產(chǎn)品與不修飾的細(xì)胞相比在小鼠體內(nèi)炎性環(huán)境下，對(duì)自 身免疫病及免疫紊亂等系統(tǒng)性免疫疾病具有更加持久和明顯的效果。
[0018] 在小鼠體內(nèi)用藥物誘導(dǎo)腸炎后，通過(guò)尾靜脈輸入miR-21inhibitor修飾后的 BMMSCs，發(fā)現(xiàn)輸入轉(zhuǎn)染miR-21inhibitorBMMSCs組的治療效果明顯優(yōu)于轉(zhuǎn)染對(duì)照組及不 轉(zhuǎn)染組，且改善血清免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo)，恢復(fù)體內(nèi)免疫。即本發(fā)明所制備的干細(xì)胞產(chǎn)品在體內(nèi) 具有更明顯的治療效果。
[0019] 具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和說(shuō)明見實(shí)施例部分。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 1.圖1為實(shí)施例I:實(shí)驗(yàn)中所使用干細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定；
[0021] 2.圖2為實(shí)施例2 :在細(xì)胞中miR-21轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染濃度篩選；
[0022] 3.圖3為實(shí)施例3 :miR-21沉默最佳轉(zhuǎn)染濃度篩選制備miR-21inhibitor-MSCs的 方法；
[0023] 4.圖4為實(shí)施例4:轉(zhuǎn)染miR-21inhibitor不影響小鼠BMMSCs的增殖和凋亡；
[0024] 5.圖5為實(shí)施例5 :miR-21負(fù)向調(diào)控中細(xì)胞內(nèi)TGF-f3 1的表達(dá)水平；
[0025] 6?圖6為實(shí)施例6 :miR-21負(fù)向調(diào)控BMMSCs的免疫調(diào)節(jié)能力；
[0026] 7.圖7為實(shí)施例7 :TGF-P1抗體可中和miR-21調(diào)控BMMSCs免疫調(diào)節(jié)能力效應(yīng)；
[0027] 8.圖8為實(shí)施例8 :miR-21沉默BMMSCs能夠更加有效治療DSS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn) 性腸炎；
[0028] 9.圖9為實(shí)施例9 :miR-21沉默BMMSCs上調(diào)腸炎小鼠血清TGF-P1及下調(diào)IL-17 水平。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 細(xì)胞培養(yǎng)
[0030] 實(shí)驗(yàn)材料健康人骨髓來(lái)自于外傷或正頌外科需要腓骨移植患者，健康人牙周組 織來(lái)自于因正畸需要無(wú)感染的前磨牙或第三磨牙，健康人乳牙牙髓組織來(lái)自于臨床因滯留 而需要拔除的乳牙。
[0031] 1.人牙源性MSCs的培養(yǎng)
[0032] 人牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)
[0033] 新鮮拔除的牙齒立即放入裝有無(wú)菌PBS和抗生素的離心管，在12小時(shí)內(nèi)分離培養(yǎng) 牙髓干細(xì)胞。用無(wú)菌紗布包裹牙齒硬組織，并用酒精浸泡消毒過(guò)的錘子敲打并敲開牙體獲 得牙髓組織，用PBS反復(fù)清洗，盡量剪碎，置含3mg/mlI型膠原酶和4mg/mlDispase溶液 中，37°C水浴消化0. 5-1小時(shí)，過(guò)70ym細(xì)胞篩收集細(xì)胞，1000 rpm離心lOmin，用