無血清培養(yǎng)基及干細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及無血清培養(yǎng)基及干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，在干細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)體系中均加入了一定比例的動物血清，比較常用的是 胎牛血清或新生小牛血清。血清是由很多大小不同生物分子組成的極為復(fù)雜的混合物，它 對細(xì)胞在體外培養(yǎng)時的主要作用是提供生長因子、激素、結(jié)合蛋白，并提供保護(hù)作用。但它 也含有一些不利于細(xì)胞生長的抑制因子或毒性物質(zhì)，具有潛在的細(xì)胞毒性作用。血清中大 量成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)，給細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化帶來困難，同時也給細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)品分離純 化帶來很大的困難。而且動物血清可能存在動物攜帶的已知或未知病原體，對以后可能的 臨床應(yīng)用構(gòu)成威脅，對用于規(guī)?；囵B(yǎng)干細(xì)胞增加了難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)中利用動物血清培養(yǎng)細(xì)胞存在一定 的毒性作用及病原體污染等缺陷，提供一種無毒性且無污染的無血清培養(yǎng)基。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng) 基，還包括胰島素、含鐵的食品添加劑、亞硒酸鈉、纖粘連蛋白、胰高血糖素、肝細(xì)胞生長因 子和青鏈霉素。
[0005] 在本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基中，所述含鐵的食品添加劑包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、檸檬酸 鐵、二甲胂酸鐵和葡糖酸鐵中的一種或多種。
[0006] 在本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基中，所述無血清培養(yǎng)基中，亞硒酸鈉的濃度為 5-20yg/ml、含鐵的食品添加劑的濃度為2-10yg/ml、胰島素的濃度為2-10yg/ml、纖粘 連蛋白或?qū)诱尺B蛋白的濃度為0. 1-2yg/ml、胰高血糖素的濃度為I-IOyg/ml、肝細(xì)胞生 長因子的濃度為10_30ng/ml，以及青鏈霉素的濃度為20-200U/ml。
[0007] 在本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基中，還包括表皮生長因子和HEPES。
[0008] 在本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基中，所述表皮生長因子的濃度為10_30ng/ml和 HEPES的濃度為 5-20mmol/l。
[0009] 在本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基中，還包括氫化可的松、地塞米松和雌激素三者中 的一種。
[0010] 在本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基中，所述氫化可的松的濃度為6-10nmol/l，或，地塞 米松的濃度為0.l_2nmol/ml，或，雌激素的濃度為l-10nmol/l。
[0011] 在本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0012] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0013] 獲取干細(xì)胞，采用上述的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)。
[0014] 實(shí)施本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基及干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，可以達(dá)到以下有益效果： 1、采用無血清培養(yǎng)基能夠避免現(xiàn)有技術(shù)存在血清批次間的質(zhì)量差異，提高細(xì)胞培養(yǎng)和試驗(yàn) 結(jié)果的重復(fù)性；2、可避免現(xiàn)有技術(shù)存在的血清所帶來的外源性污染及血清組分的細(xì)胞毒性 作用；3、能夠避免不明的血清組分對細(xì)胞培養(yǎng)及試驗(yàn)研究的影響；4、成份相對明確、質(zhì)量 一致且蛋白含量低，有利于提高細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的穩(wěn)定性并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化；5、能夠延 長細(xì)胞的GI期或迫使細(xì)胞處于GO期而較長時間的維持細(xì)胞高密度培養(yǎng)，從而盡可能的生 產(chǎn)目的產(chǎn)物，并更好地保持干細(xì)胞的特性。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中采用含有動物血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)干細(xì)胞血清組分存在易產(chǎn)生 毒性作用，并攜帶有病原體且細(xì)胞分離純化困難等缺陷，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于提供一種無 血清培養(yǎng)基，通過在培養(yǎng)基中加入能夠替代血清的補(bǔ)充因子，從而實(shí)現(xiàn)了無污染培養(yǎng)干細(xì) 胞，提尚細(xì)胞廣品生廣穩(wěn)定性的目的。
[0016] 本發(fā)明提供的一種無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰島素、含鐵的食品添加劑、 亞硒酸鈉、纖粘連蛋白、胰高血糖素、肝細(xì)胞生長因子和青鏈霉素。
[0017] 其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖是細(xì)胞生長增殖以及產(chǎn)物表達(dá)過程中的重要能量來 源，優(yōu)選地，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，該DMEM/F12培養(yǎng)基中含有極其豐富和復(fù)雜的 細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，能夠支持多種類型細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)基中生長。
[0018] 胰島素能夠促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和蛋白質(zhì)，促進(jìn)RNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成， 抑制細(xì)胞凋亡，是非常重要的細(xì)胞存活因子；優(yōu)選地，無血清培養(yǎng)基中，胰島素的濃度為 2-10yg/ml〇
[0019] 微量元素鐵是細(xì)胞生長增殖所必需的，含鐵的食品添加劑可以為轉(zhuǎn)鐵蛋白、檸檬 酸鐵、二甲胂酸鐵和葡糖酸鐵中的一種或多種；優(yōu)選地，含鐵的食品添加劑為轉(zhuǎn)鐵蛋白，因 為大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞上均存在特定的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體與轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物結(jié) 合是細(xì)胞獲取必需的微量元素鐵的主要來源，此外，轉(zhuǎn)鐵蛋白還具有生長因子的性質(zhì)并能 與其他微量元素如釩等結(jié)合，為細(xì)胞生長增殖提供必需的微量元素。優(yōu)選地，無血清培養(yǎng)基 中，含鐵的食品添加劑的濃度為2-10yg/ml。
[0020] 進(jìn)一步地，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的酪氨酸、色氨酸、核黃素、抗壞血酸 鹽等會產(chǎn)生大量的過氧化氫，過氧化氫是細(xì)胞生長和克隆的主要毒性物質(zhì)，會引起細(xì)胞膜 上的飽和脂肪酸、細(xì)胞蛋白質(zhì)氧化和/或DNA損傷而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，在本發(fā)明提供的 無血清培養(yǎng)基中加入適量的亞硒酸鈉，亞硒酸鈉中的微量元素硒參與谷胱甘肽過氧化物酶 和過氧化物歧化酶的作用過程，從而能夠消除氧化物酶和氧自由基對細(xì)胞的傷害；優(yōu)選地， 該無血清培養(yǎng)基中，亞硒酸鈉的濃度為5-20yg/ml。
[0021] 此外，許多動物細(xì)胞必須貼壁才能生長，而無血清培養(yǎng)基中，由于缺乏血清中的各 種粘附貼壁因子，細(xì)胞往往以懸浮形式生長，而不利于細(xì)胞增殖。因此，通過在無血清培養(yǎng) 基中加入促貼壁物質(zhì)來彌補(bǔ)這一缺陷，促貼壁物質(zhì)一般為細(xì)胞外基質(zhì)，可以是纖粘連蛋白 或?qū)诱尺B蛋白等，同時，促貼壁物質(zhì)還是重要的分裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子， 對許多細(xì)胞的繁殖和分化起重要作用。優(yōu)選地，促貼壁物質(zhì)為纖連蛋白，主要促進(jìn)中胚層細(xì) 胞的貼壁與分化；無血清培養(yǎng)基中，纖粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白的濃度為〇. 1-2yg/ml。
[0022] 胰高血糖素能夠參與細(xì)胞的糖代謝、脂類代謝等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增值與功能表達(dá)；優(yōu) 選地，胰高血糖素的濃度為1-10yg/ml。
[0023] 肝細(xì)胞生長因子能夠刺激細(xì)胞的增殖分化；優(yōu)選地，肝細(xì)胞生長因子的濃度為 l〇-30ng/ml〇
[0024] 青鏈霉素通過與細(xì)菌的核糖體相結(jié)合，從而抑制細(xì)菌內(nèi)蛋白質(zhì)的合成而導(dǎo)致細(xì)菌 死亡，可預(yù)防細(xì)菌的生長，且青鏈霉素的毒性作用較小，可忽略對細(xì)胞生長增殖的影響；優(yōu) 選地，青鏈霉素的濃度為20_200U/ml。
[0025] 綜上所述，本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基不僅可避免血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞所造成的 病原體污染，以及細(xì)胞分離純化等問題，而且能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長增殖。
[0026] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基還包括表皮生長因子等多肽類生長因子， 以及HEPES(中文名：輕乙基哌嗪乙硫磺酸，2-[4-(2_Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonicacid，），這些物質(zhì)對于細(xì)胞的生長增殖均具有積極地促進(jìn)作用。其中，多 肽類生長因子能夠刺激細(xì)胞的增殖分化；HEPES能夠補(bǔ)償無血清造成的緩沖能力下降，以 維持細(xì)胞生長所需的酸堿度；優(yōu)選地，表皮生長因子的濃度為10_30ng/ml、HEPES的濃度為 5_20mmol/l〇
[0027] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基還包括氫化可的松、地塞米松和雌激素三 者中的一種，能夠參與細(xì)胞的糖代謝、脂類代謝等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增值，促進(jìn)細(xì)胞功能表達(dá)。優(yōu) 選地，氫化可的松的濃度為6-10nmol/l，或，地塞米松的濃度為0.l-2nmol/ml，或，雌激素 的濃度為l-10nm〇l/l。
[0028] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，在本實(shí)施例中，干細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì) 胞，當(dāng)然本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基也可應(yīng)用于其他類型的干細(xì)胞，本實(shí)施例間充質(zhì)干細(xì)胞的 培養(yǎng)方法包括如下步驟：
[0029] 1)獲取間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0030] 2)采用本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0031] 其中，步驟1)獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的過程為：
[0032] 取人骸關(guān)節(jié)或下肢骨骨髓標(biāo)本，肝素抗凝，按1:2的比例加在密度為I. 073g/ml 的peroll分離液上2300rpm離心30min，取中層單核細(xì)胞，加入PBS緩沖液，1000 rpm離心 lOmin，洗滌3次，棄上清液。所得原代間充質(zhì)干細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整至IXIO7個 /培養(yǎng)瓶（25ml)密度用DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0033] 可以理解的是，以上僅為本發(fā)明提供的其中一種獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的途徑，現(xiàn)有 技術(shù)中，間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取方式同樣適用于本發(fā)明。
[0034] 步驟2)具體過程為：
[0035] 當(dāng)步驟1)中的細(xì)胞生長到幾乎完全融合時，傾去舊培養(yǎng)基，用PBS液漂洗2~3 次，傾去PBS液，加入0? 25%的胰蛋白酶（內(nèi)含0? 02%EDTA乙二胺四乙酸）消化，加入量以 使胰蛋白酶可以完全覆蓋瓶底的細(xì)胞為準(zhǔn)。將培